< Terug naar vorige pagina

Project

Productie van de bio-detergenten rhamnolipiden door een niet-pathogene gastheer (178BW0213)

 

 

Biosurfactanten, surfactant moleculen geproduceerd door micro-organismen of vanuit hernieuwbare grondstoffen, zijn een evenwaardig alternatief voor de tegenwoordig veelgebruikte (petro)chemische surfactanten. Een veelvoud aan potentiele toepassingen zijn reeds bekend gaande van huishoudelijke tot farmaceutische applicaties zijn al reeds bekend. Andere aspecten zoals hun biodegradeerbaarheid, hernieuwbare productie en potentiele biologische activiteit hebben ervoor gezorgd dat de interesse naar deze moleculen gevoelig gestegen is. Ondanks deze voordelen zijn nog enkele grote nadelen verbonden aan deze verbindingen. Zo is de productiekost nog steeds significant hoger en is de structurele variatie van de reeds gecommercialiseerde moleculen beperkt.

Een interessante deelklasse van de biosurfactanten, namelijk de glycolipiden, werden reeds uitvoerig bestudeerd. Men dient echter in gedachten te houden dat deze klasse van moleculen slechts een handvol variaties kent voor zowel het koolhydraat als het vetgedeelte van de glycolipide. Een specifiek voorbeeld zijn de sophorolipiden. Alle moleculen van deze subklasse zijn samengesteld uit een sophorose en een C18 vetzuur. Eventuele verzadiging van de C18 staart of de locatie van de hydroxylatie kunnen variëteit veroorzaken maar ketens met langere of kortere varianten zijn quasi onbestaande. De enige uitzondering hiervoor zijn de moleculen van R. bogoriensis die standaard een C22 vetzuurketen hebben. Het is echter niet onmogelijk afwijkende vetzuren of analoge moleculen te incorporeren maar vaak leidt dit tot een meer complex mengel moleculen of tot lagere productieniveaus. Verder is het belangrijk de productiecapaciteit van bepaalde organismen niet te vergeten. Slechts enkele zijn in staat tot hoge en snelle productie van biosurfactanten zoals P. aerugiosa of S. bombicola. Nadelen zoals potentiele pathogeniciteit kunnen echter een grote rol spelen in de kostprijs en applicaties van bepaalde moleculen.

Het gebruik maken van robuuste micro-organismen voor de productie van eigen wild-type, gemodificeerde wild-type of nieuwe types van moleculen kan een interessante strategie zijn om enerzijds de kostprijs van biosurfactanten te laten dalen en anderzijds om de moleculaire diversiteit te vergroten. Dit is in het verleden als reeds enkele malen toegepast op kleine schaal.

Gedurende dit eindwerk werd getracht S. bombicola om te vormen tot een robuuste producent van verscheidene moleculen. Nieuwe inzichten op het vlak van genetische modificaties alsook op procesniveau zorgden voor een diepere kennis betreffende de productie van deze moleculen.

In hoofdstuk twee werden verscheidene nieuwe technieken getest voor het modificeren en opvolgen van S. bombicola. Een eerste techniek bestond uit het ontwikkelen van een plasmide voor S. bombicola. Hoewel verscheidene micro-organismen een of meerdere types van plasmide hebben is er tot op heden geen bekend voor S. bombicola. Door gebruik te maken van in silico screeningstechnieken alsook het uittesten van enkele homologe en heterologe sequenties werd getracht een gelijkaardig systeem te ontwikkelen maar tot op heden zonder succes. De tweede techniek betreft de grootte van de recombinatie cassettes. Hoewel slechts enkele groottes getest zijn werd snel duidelijk dat voor het gros van de modificaties geen reële limiet bestaat. Vanuit een meer praktisch oogpunt werd besloten om de gencluster van de sophorolipiden synthese te verdubbelen. Hoewel initieel verwacht werd dat het hogere kopij aantal van de genen tot verhoogde transcriptie, translatie en productie zou leiden, werd snel duidelijk dat dit niet het geval was. Desalniettemin was het duidelijk dat grote cassettes gebruikt kunnen worden voor het efficiënt introduceren van grote en/of complexe metabolische netwerken in een beperkt aantal tussenstappen. De laatste tool bestond uit het introduceren van fluorescente eiwitten en kan beschouwd worden als meerdere kleine tools tezamen. Allereerst werden twee nieuwe fluorescente eiwitten correct tot expressie gebracht in S. bombicola. Dit opent mogelijkheden met meerdere promotoren of localisatiesignalen tegelijkertijd te testen. Ten tweede werd aangetoond dat het koppelen van extra domeinen aan bepaalde enzymen niet zorgt voor een daling in activiteit. Dit kan in de toekomst verder benut worden door het koppelen van andere katalytische elementen tot grote chimere eiwitten met een verhoogd omzettingsvermogen. Tot slot zorgde het koppelen van de fluorescente eiwitten aan deze enzymen van de sophorolipiden synthese voor enerzijds het lokaliseren van deze moleculen binnenin de cel en anderzijds voor een visuele tool om expressieniveaus te kunnen meten en tegelijkertijd te koppelen aan productiviteit. Wanneer deze data gekoppeld wordt met qPCR data kan een beter begrip van de eiwitexpressie bekomen worden en kan deze beter afgesteld worden om een zo min mogelijke impact te hebben op celvitaliteit.

Hoofdstukken drie en vier focusten beide op de modificatie van een bepaald deelaspect van de structuur van glycolipiden. Hoofdstuk drie draait om het veranderen van de vetzuurketen door middel van expressie van P450s enzymen. Het vervangen van het celeigen CYP52M1 door andere, eventueel zelfvoorzienende, P450s bleek een interessante doch niet succesvolle manier te zijn om nieuwe compatibele hydroxy vetzuren te produceren en incorporeren in glycolipiden. Hun activiteit was echter eenvoudig meetbaar wat bevestigde dat heterologe expressie van P450s functioneel kan zijn. Het muteren van enkele zelfvoorzienende P450s zorgde eveneens niet voor de gehoopte productie. De reden hiervoor kan echter gezocht worden in enerzijds een lagere activiteit van de mutant en anderzijds de productie van minder compatibele intermediairen. Het tweede deel van hoofdstuk drie was gericht op het creëren van zogenaamde chimere, zelfvoorzienende P450s. Enkele varianten zoals deze met CYP52A4 en CYP1 bleken interessante eigenschappen te hebben voor de productie van nieuwe types sophorolipiden. Voor het CYP1BMR eiwit bleek het mogelijk specifiek C16 sophorolipiden te produceren. Verdere optimalisatie resulteerde in hogere productiviteit van deze moleculen.

In hoofdstuk 4 lag de focus op het modificeren van de koolhydraatgroep. Productie van glucolipiden en cellobiose lipiden was al reeds mogelijk dankzij eerder geconstrueerde stammen maar de behaalde opbrengsten waren laag in vergelijking met de productie van sophorolipiden. Verder was de productuniformiteit niet optimaal. Het opnieuw ontwerpen van de originele recombinatiecassettes zorgde in het geval van de glucolipiden in een significant hogere productie. Hoewel deze stijging grotendeels te danken was aan het gebruiken van een specifiek ontworpen ura3 auxotrofe stam van S. bombicola bleek er een groot verschil te zijn in de verschillende cassettes en hun effect op de productie. Een andere interessante waarneming waren de bolaglucolipiden. Het was al reeds bekend dat UGTA1 in staat is om zowel hydroxyl als carboxylgroepen te glucosyleren in vivo. Voor de productie van cellobiose lipiden werd een hogere product uniformiteit behaald door enkel het ugt1 gen van U. maydis te expresseren in een ugta1 knock-out strain van S. bombicola. Hierdoor werden er geen glucolipiden meer geproduceerd en kon definitief aangetoond worden dat enkel het UGT1 verantwoordelijk is voor de dubbele glucosylering van het hydroxy palmitinezuur. Verdere optimalisatie van de productiestammen is echter nodig voor het behalen van hogere titers.  

Het laatste hoofdstuk gaat over het aanwenden van S. bombicola voor het produceren van rhamnolipiden. Rhamnolipiden zijn moleculen die structureel niet verwant zijn aan de sophorolipiden en hun synthese verloopt verschillend dan deze van de sophorolipiden. Om productie te bekomen was het noodzakelijk om bacteriële metabolische processen te integreren in S. bombicola aangezien de celeigen eukaryote netwerken niet flexibel genoeg of toereikend waren. De integratie van een type II vetzuursynthese werd ondernomen door de vereiste genen te integreren op twee verschillende locaties in het genoom. Als proof-of-concept molecule werd getracht om dimeren van U+03B2-hydroxy vetzuren te bekomen. Na enkele groeiproeven werd duidelijk dat er geen activiteit gemeten kan worden. Voor de geactiveerde rhamnose werden twee pathways in parallel getest, één specifiek voor UDP-L-rhamnose, de andere voor dTDP-L-rhamnose. Om te beschikbaarheid van het geactiveerde rhamnose te testen werd een poging ondernomen voor het rhamnosyleren van quercetine door het transferase At78D1 van Arabidopsis thaliana. Een groefproef wees uit dat de stam uitgerust met de pathway voor dTDP-L-rhamnose productie in staat was om een gerhamnosyleerd product te vormen. Een finaal experiment waarbij cellysaten van beide precursorstammen gecombineerd werden leidde uiteindelijk niet tot de productie van rhamnolipiden of andere verwante moleculen.

Als conclusie kan met stellen dat S. bombicola de nodige robuustheid bezit om te dienen als productieplatform voor verscheidenen types biosurfactanten. Hoewel enkele obstakels nog aanwezig zijn, zowel op een fundamenteel als een meer procesmatige niveau, is gebleken dat het reeds mogelijk is om industrieel relevante giststammen te ontwikkelen. De resultaten van dit werk vertellen duidelijk dat S. bombicola een relevant organisme is voor glycolipidenproductie.

Datum:1 jan 2013  →  31 dec 2016
Trefwoorden:lipiden, s. bombicola
Disciplines:Landbouw, land- en landbouwbedrijfsbeheer, Bodemwetenschappen, uitdagingen en vervuiling, Microbiologie, Andere biotechnologie, bio-en biosysteem ingenieurswetenschappen, Medische biochemie en metabolisme, Biologische systeemtechnologie, Fermentatie, Chemisch productontwerp en formulering, Algemene chemische en biochemische ingenieurswetenschappen, Andere (bio)chemische ingenieurswetenschappen, Andere (bio)medische ingenieurswetenschappen, Laboratoriumgeneeskunde, Industriële microbiologie, Engineering van biomaterialen, Systeembiologie, Industriële biotechnologie niet elders geclassificeerd, Industriële biotechnologie, Biochemie en metabolisme, Biomechanische ingenieurswetenschappen, Katalytische reactietechnieken, Process engineering, Bioverwerking, bioproductie en bioproducten, Scheidings- en membraantechnologie, Biokatalyse en enzymtechnologie, Biomateriaal engineering, Transportfenomenen, Milieu-ingenieurswetenschappen en -biotechnologie, Industriële moleculair engineering van nucleïnezuren en eiwitten