Ontmantelen van superbugs: engineeren van derde generatie lysines als enzybiotica voor brandwondinfecties

Brandwonden blijven veelvoorkomende letsels: de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) schat het aantal gevallen op zo’n 11 miljoen per jaar wereldwijd. Een delicaat evenwicht tussen een pro- en anti-inflammatoire respons is cruciaal voor goede genezing van dergelijke verwondingen, wat ze moeilijk te behandelen maakt. Dit delicate evenwicht wordt vaak verstoord door infecties met opportunistische pathogenen die kunnen leiden tot levensbedreigende situaties. Veelvoorkomende brandwondpathogenen zoals Staphylococcus aureus en Acinetobacter baumannii zijn gekend voor hun vermogen om deze wonden persistent te koloniseren, wat zich uit in biofilmvorming. Bovendien zijn beide organismen door de WHO vooruitgeschoven als prioriteitspathogenen voor het ontwikkelen van nieuwe antibiotica in het kader van de huidige antibacteriële resistentiecrisis. Beleidsmakers zijn ervan overtuigd dat deze crisis kan opgelost worden door enerzijds het gebruik van de huidige strategieën terug te schroeven en anderzijds nieuwe antibacteriële strategieën te ontwikkelen.

Bacteriofagen, virussen die specifiek bacteriën infecteren, zijn al eeuwenlang verwikkeld in deze evolutionaire wapenwedloop tegen bacteriële resistentie. Vanuit dit standpunt coderen bacteriofagen een breed scala aan antibacteriële eiwitten die kunnen gebruikt worden als een bron van bacteriofaag-geïnspireerde antibiotica. Een voorbeeld hiervan vormen endolysines, peptidoglycaan-afbrekende enzymen die tot expressie komen aan het einde van de lytische infectiecyclus, waar ze lysis van de bacteriële gastheer induceren om zo een nieuwe generatie aan bacteriofaagpartikels vrij te stellen. Het potentieel van deze endolysines werd duidelijk wanneer ze toegevoegd werden aan een cultuur met Gram-positieve bacteriën. Dit resulteerde in snelle lysis. Twee decennia later worden deze eerste generatie van lysines getest in een fase III klinische proef als nieuw antibioticum tegen S. aureus. Activiteit tegen Gram-negatieve pathogenen zoals Pseudomonas aeruginosa en A. baumannii werd bereikt door het verder optimaliseren van deze eiwitten. Het verwisselen van enzymatische domeinen en andere benaderingen resulteerde dan ook in varianten met een superieure antibacteriële activiteit of verbeterde biochemische eigenschappen, wat leidde tot een tweede generatie van lysines.

Er is echter nog ruimte voor verbetering. Het zou interessant kunnen zijn om het lysine af te stemmen op zijn uiteindelijke klinische toepassing. Dergelijke strategieën worden gedefinieerd als derde generatie engineering strategieën. Hiervoor zijn betrouwbare modellen noodzakelijk die deze uitdagingen ook weergeven. Daarom beschrijft het eerste deel van dit proefschrift een ex vivo brandwondmodel om experimentele antibacteriële therapieën te evalueren. Waar de meerderheid van zulke modellen tijdsintensieve CFU-tellingen of qPCR methodes gebruiken op discrete tijdspunten, werd het gebruik van bioluminescente stammen in dit model geïmplementeerd. Deze ingreep zorgde ervoor dat meerdere therapieën tegelijk getest konden worden en verhoogde bovendien de tijdsresolutie, wat het mogelijk maakte herkolonisatie van het explant op te volgen. Bovendien werd de tijdsintensiviteit significant verlaagd. Verder werd een Tn7-gebaseerd labelsysteem ontwikkeld zodat dit model kan worden gebruikt voor eender welke Gram-negatieve, klinische stam. Dit systeem maakt het mogelijk om een reportergen op een specifieke plaats van het bacteriële chromosoom te integreren en werd gebruikt om A. baumannii NCTC 13423 met het luxCDABE operon uit te rusten. Gerichte genomische integratie werd gevalideerd door Nanopore sequencing en de novo genoomassemblage. Tenslotte werd deze stam gevalideerd in het ex vivo model, resulterend in een nieuwe tool om nieuwe (faag-geïnspireerde) antibacteriële therapieën te evalueren voor toepassing in een brandwonde.

Het tweede deel van dit proefschrift verkent een nieuw derde-generatie concept voor het optimaliseren van lysines voor de behandeling van brandwondinfecties. Gezien soort infecties typisch gekarakteriseerd worden door een verstoorde immuunrespons en biofilmvorming, werd een fusie met immunomodulatoire peptiden die biofilms kunnen ontwrichten uitgetest. Specifieke VersaTile bibliotheken werden gemaakt met 14 verschillende peptiden en één geëngineerd lysine tegen S. aureus, LysRODI∆amidase. Hoewel initieel vier hits werden gevonden, gevalideerd met drie onafhankelijke muralytische assays, bleek fragmentatie van deze hits een grote uitdaging te zijn in dit concept. Uit een andere gevalideerde conceptbibliotheek met als hoeksteen 1D10, ontwikkeld tegen A. baumannii, werden drie hits gevonden, waarvan één werd beschouwd als hit zonder uitgesproken fragmentatie.

Uit verder onderzoek op deze variant, BZAb1, bleek dat deze variant superieure antibacteriële activiteit vertoonde in een log-reductie test in vergelijking met 1D10. Anderzijds kon dit superieur karakter niet bevestigd worden in het ex vivo model. Daarom kan het relevant zijn om in de toekomst dergelijke bibliotheken meteen in dergelijk ex vivo model te screenen. Op die manier worden lysines die in exact die omgeving superieure activiteiten bezitten, geïdentificeerd. Verder werd BZAb1 gekarakteriseerd als nauw-spectrum lysine, gezien een lage dosis van BZAb1 alleen de groei van A. baumannii stammen kon inhiberen. Wat betreft derde generatie eigenschappen, kon BZAb1 geen 24 uur oude biofilms ontwrichten en er werd ook geen anti-inflammatoir effect vastgesteld in RAW264.7 macrofagen. Anderzijds kon wel een potentieel anti-inflammatoir effect bevestigd worden gezien dit lysine in vitro LPS kon binden. Tenslotte werd geen cytotoxiciteit gevonden in HeLa cellen. Dit proefschrift beschrijft dus het eerste derde generatie lysine tegen een Gram-negatieve pathogeen.

Dit tweede deel bevestigt de hypothese dat het mogelijk is om extra eigenschappen in één enkel fusie-eiwit te integreren. Anderzijds maakten deze proof-of-concept bibliotheken met synthetische linkers ook duidelijk dat dergelijke fusie-eiwitten erg kwetsbaar kunnen zijn. Daarom zou men in de toekomst kunnen opteren om natuurlijk voorkomende linkers of zelfs helemaal geen linkers te gebruiken en zo autoproteolyse tegen te gaan. Bovendien kunnen met innovatieve coformulatiestrategieën van deze actieve componenten met bijvoorbeeld anti-inflammatoire componenten eenzelfde effect bereiken.

Tenslotte kan geconcludeerd worden dat derde generatie lysine engineering in de toekomst meer succes kan hebben wanneer minder toxische fusiepartners gekozen worden, die ook zullen resulteren in een hogere eiwitopbrengst. Innovatieve benaderingen, niet enkel in het lysineveld, maar ook in andere delen van de ontwikkelingssector voor antibiotica, zullen in de toekomst de motor zijn van de transitie naar antibacteriële therapieën. Op deze manier kan de stille pandemie van antibacteriële resistentie overwonnen worden.