Opweg naar de ontwikkeling van antivirale geneesmiddelen tegen norovirus: het samenstellen vanunieke modelsystemen om de werkzaamheid en het werkingsmachanisme van nieuwe inhibitoren te bestuderen

Humane norovirussen (HuNoV's) zijn positief enkelstrengige RNA virussen die behoren tot de familie van de Caliciviridae. HuNoV infecties leiden tot acute gastro-enteritis met braken en waterige, niet-bloederige diarree. Deze infecties komen wereldwijd voor en zijn een belangrijk gezondheidsprobleem dat alle leeftijdsgroepen treft, met jaarlijks 200.000 sterfgevallen tot gevolg. Het oplopen van een infectie gebeurt via de fecaal-orale route: door consumptie van besmet voedsel of water en door persoonlijk contact. HuNoV is zeer besmettelijk en overleeft lang in de omgeving. Daarom komen grote uitbraken vaak voor, voornamelijk in ziekenhuizen, instellingen voor langdurige zorg en andere semi-gesloten omgevingen. Omdat er nog geen antivirale middelen zijn om HuNoV infecties te behandelen en/of te voorkomen is de huidige therapie slechts ondersteunend. Een geneesmiddel voor profylactische gebruik of voor de behandeling van HuNoV infecties is dringend nodig. Verschillende stappen in de virale replicatiecyclus zijn onderzocht als antivirale doelen (Hoofdstuk 1).
           
Diverse humane virussen kunnen acute gastro-enteritis veroorzaken. We onderzochten daarom een symptoom-gebaseerde behandeling voor deze virale gastro-enteritis, door in vitro het antivirale effect van 2-C-nucleosides op rota, noro en sapovirus te bestuderen (Hoofdstuk 3). De krachtigste nucleosideanaloog, 7‑deaza-2'-C-methyladenosine (7DMA), was in staat de replicatie van al deze virussen te remmen (EC50 <5 µM). Mechanistisch laten we zien dat de 2'-C-methyl-nucleosideanalogen de transcriptie van het rotavirus genoom remmen. In dit hoofdstuk leveren we het eerste bewijs dat één behandeling voor virussen die acute gastro-enteritis kunnen veroorzaken mogelijk is en dit door een geneesmiddel te ontwikkelen dat gericht is tegen het virale polymerase. 
Een van de belangrijkste redenen voor het ontbreken van antivirale therapieën tegen virale gastro-enteritis was het gebrek aan geschikte celkweeksystemen en diermodellen. Het HuNoV was voor een lange tijd niet op te groeien in vitro het antivirale onderzoek wordt daarom voornamelijk nu uitgevoerd op het muizen norovirus (MNV) of het HuNoV GI.1 replicon. Pas recent zijn onderzoekers erin geslaagd om het HuNoV te laten repliceren in celcultuur: in een menselijke B-cellijn (BJAB) of in uit stamcellen afgeleide enteroïden. We zijn er in geslaagd een nieuw klein diermodel te ontwikkelen om HuNoV replicatie te bestuderen met behulp van zebravislarven (Hoofdstuk 4). Wanneer het virus geïnoculeerd wordt in de dooier van drie dagen oude zebravis larven, repliceren zowel HuNoV GI als GII tot hoge titers. De HuNoV replicatie bereikt zijn piek op dag twee na infectie en is gedurende minimaal zes dagen detecteerbaar. HuNoV GII.4 kan twee opeenvolgende keren van larve naar larve worden overgebracht. Met behulp van immuunhistochemische kleuringen konden we HuNoV antigenen detecteren in de hematopoëtische cellen en in de darm van de geïnfecteerde zebravis larven. Bovendien kon de HuNoV-replicatie worden geremd met >2 log10 door een bekende norovirusremmer, 2CMC, toe te voegen aan het zwemwater van de met HuNoV geïnfecteerde zebravislarven. In conclusie, hebben we hier een eenvoudig en robuust in vivo replicatiemodel geïmplementeerd dat een belangrijke troef zal zijn in het onderzoek naar geneesmiddelen voor de behandeling van HuNoV infecties.   

De virale niet-structurele eiwitten vormen een aantrekkelijk doelwit voor het ontwikkelen van antivirale geneesmiddelen. Het eerste niet-structurele eiwit dat we onderzochten was het norovirus protease (NS6). Het protease is essentieel om de polyproteïne-precursor te splitsen in de individuele niet-structurele eiwitten. Samen met het team van prof. Hong Liu werd een klasse van peptidomimetische aldehyden ontworpen op basis van de chemische structuur van rupintrivir, een bekende norovirus proteaseremmer (Hoofdstuk 5). We selecteerden aanvankelijk product 4 (EC50 MNV: 0,71±0,24 μM, EC50 HuNoV GI.1: 1,21±0,58 μM). Product 4 was in staat om het HuNoV GI.1 replicon efficiënt uit de gastheercellen te verwijderen na twee passages van elk drie dagen (10 µM). Na drie maanden selectieve druk werd een product 4res GI.1 replicon variant gegenereerd bij 16 µM, wat resulteerde in een ~10-voudige toename in EC50 tegen zowel product 4 als rupintrivir. De resistente variant draagt een mutatie (I109V) in een sterk geconserveerd gebied van het virale protease. Met behulp van een cel gebaseerde FRET‑sensor, bevestigden we dat product 4 niet alleen de proteolytische activiteit van het GI.1‑protease inhibeert, maar ook de proteolytische activiteit van de GII en GV proteases. Nadat een nieuwe ronde van derivaten was gesynthetiseerd, bleek product 10d ~100 keer krachtiger te zijn. Ten slotte bleken zowel product 4 als product 10d ook in vivo actief te zijn, de replicatie van HuNoV GII.4 in zebravislarven kon worden afgeremd na een injectie van de producten in de pericardiale ruimte van geïnfecteerde zebravislarven. In conclusie, we hebben een nieuwe klasse norovirusremmers geïdentificeerd met in vitro en in vivo activiteit en een zeer hoge barrière tegen resistentie.        
Het tweede niet-structurele eiwit dat we hebben onderzocht, was het norovirus RNA‑afhankelijke RNA-polymerase (RdRp), een essentieel eiwit voor virale replicatie. Samen met het team van Prof. Silvestri werden ~1000 kleine moleculen ontworpen en gescreend op antivirale activiteit tegen MNV (Hoofdstuk 6). Het molecule 3‑(3,5‑dimethylfenyl) sulfonyl‑5‑chloorindool-N‑(phenylmethanol‑4‑yl) carboxamide (RS5105) werd geïdentificeerd als een interessante hit (EC50 MNV: 0,5±0,1 µM). Een reeks analogen werd gesynthetiseerd waarvan RS5111 een verbeterde potentie/selectiviteit had (EC50 MNV: 0,2±0,1 µM en EC50 HuNoV GI replicon: 1,2±0,6 µM). Time-of-drug-addition (TOA) studies toonden aan dat de werking van RS5111 samenvalt met de start van de virale RNA replicatie, hoewel RS5111 de activiteit van de MNV RdRp niet direct remt. Na zes maanden selectieve druk werden twee onafhankelijk MNV RS5111res varianten geselecteerd en beide bleken één mutatie in VPg en drie mutaties in de RdRp te bevatten. Na de constructie van een recombinant MNV waarin we S131T en Y154F als unieke mutaties introduceerden, vonden we geen duidelijk RS5111res fenotype. Het inbrengen van de andere mutaties of een combinatie van mutaties is nog aan de gang. Het antivirale effect van RS5111 werd bestudeerd in met HuNoV geïnfecteerde zebravislarven en dit door RS5111 toe te voegen aan het zwemwater, in de behandelde zebravis larven werden er 0,5‑1 log10 minder HuNoV GII.6 RNA-kopieën gedetecteerd. We presenteren hier een klasse van nieuwe norovirus remmers met een hoge barrière tegen resistentie en een goede antivirale activiteit in vitro en in vivo tegen de meest relevante HuNoV genogroepen.

In deze thesis hebben we bewijs geleverd dat het ontwikkelen van een syndroomgerelateerd breed‑spectrum antiviraal geneesmiddel mogelijk is. Bovendien waren we in staat om zebravislarven te implementeren als een robuust in vivo model om HuNoV-replicatie te bestuderen. Ten slotte konden we in samenwerking met medicinale chemici nieuwe anti‑norovirusmoleculen identificeren en karakteriseren, die gericht zijn op het sterk geconserveerde virale protease of polymerase.