CoMuTER - een Cas3-base editing tool voor doelgerichte in vivo mutagenese

Genetische diversiteit is van vitaal belang voor de evolutie en de aanpassing van soorten aan hun omgeving. De opeenstapeling van mutaties in het DNA, die leiden tot fenotypische veranderingen, is een natuurlijk proces dat zich vaak in de loop van duizenden jaren voltrekt. Om de evolutie van micro-organismen in laboratorium- en industriële contexten te versnellen en te sturen zijn wetenschappers evolutionary engineering gaan gebruiken als strategie. Omdat de natuurlijke snelheid waarmee mutaties zich ophopen relatief traag is en het aanbod van gunstige mutaties laag is, is er een grote behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe strategieën die evolutionaire manipulatie vergemakkelijken. Hulpmiddelen waarmee het DNA van micro-organismen snel gediversifieerd kan worden, zijn zeer waardevol om fenotypes te optimaliseren, met name in celfabrieken die gericht zijn op de productie van specifieke verbindingen uit heterologe routes. Eén methode om genetische diversiteit te vergroten is via willekeurige mutagenese. Conventionele mutagenen, zoals UV en EMS, zijn niet specifiek en tasten het hele genoom aan, waardoor het risico bestaat dat ze naast de gewenste mutaties ook ongewenste mutaties genereren. Omgekeerd hebben strategieën voor het introduceren van willekeurige mutaties in specifieke regio's beperkingen vanwege hun relatief kleine activiteit (<3 kb), die ontoereikend blijken te zijn voor het diversifiëren van meerdere genen of hele pathways.

In dit proefschrift presenteren we CoMuTER (Confined Mutagenesis using a Type I-E CRISPR-Cas system), een nieuwe tool die de kloof overbrugt tussen het muteren van relatief smalle DNA-gebieden en genoombrede mutagenese. De kern van CoMuTER is het klasse 1 type I-E CRISPR-Cas systeem, dat we hebben aangepast voor induceerbare en doelgerichte in vivo mutagenese. De tool maakt gebruik van de doelgerichte helicase Cas3, het kenmerkende enzym van het klasse 1 type I-E CRISPR-Cas systeem, samengevoegd met een cytidine deaminase om uitgebreid stukken DNA in één keer af te wikkelen en te muteren, inclusief complete metabolische routes. We ontwierpen en bouwden CoMuTER in twee verschillende S. cerevisiae stammen, omdat dit micro-organisme vaak wordt gebruikt als celfabriek voor industriële omgevingen. We voerden een uitgebreide evaluatie uit van de tool, waarbij we ons concentreerden op de induceerbaarheid en doelgerichtheid op specifieke loci met behulp van loss-of-function-screening. Met behulp van ampliconsequencing en sequenering van het volledig genoom zagen we aanzienlijke variatie in het aantal- en de verdeling van geïntroduceerde mutaties tussen de replicaten, waardoor een diverse populatie ontstond die de basis vormt voor het screenen en selecteren van verbeterde fenotypes. Het systeem was in staat om genomische loci te muteren die zich uitstrekten tot 55 kilobasen, waarbij gemiddeld 0,3 mutaties per kb werden geïntroduceerd, met een 350-voudige toename in on-target activiteit vergeleken met de rest van het genoom. Tot slot werd CoMuTER gebruikt om de productie van lycopeen van een heterologe route in S. cerevisiae te verbeteren, wat leidde tot een tweevoudige verbetering van de productopbrengst na één inductieronde. Daarnaast gebruikten we onze tool om resistentie verlenende mutaties te genereren voor remmers van het essentiële enzym SEC14. Deze proof-of-concept experimenten onderstrepen het potentieel van het systeem voor genetische diversificatie en evolutionaire engineering.