< Terug naar vorige pagina

Project

Opheldering van de molculaire gevolgen van inhibitie van LRRK2, een kinase betrokken in de ziekte van Parkinson.

De ziekte van Parkinson is de tweede meest voorkomende neurodegeneratieve aandoening, na de ziekte van Alzheimer, en de meest voorkomende bewegingsstoornis. Wereldwijd lijden 7 tot 10 miljoen mensen aan deze ziekte en dit aantal zal waarschijnlijk alleen maar stijgen door de optredende vergrijzing. Het zijn namelijk vooral mensen ouder dan 60 jaar, die door deze ziekte worden getroffen. Het exacte ontstaansmechanisme van de ziekte van Parkinson is nog niet volledig gekend. Momenteel zijn er nog geen behandelingen beschikbaar die patiënten kunnen genezen, enkel behandelingen die de symptomen (tijdelijk) kunnen onderdrukken.
Sinds 1997 hebben genetische studies al verschillende mutaties geïdentificeerd, die aan de oorzaak liggen van de ziekte. Zo zijn mutaties in het leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) gen tot op heden de meest voorkomende gekende oorzaak van genetische vormen van de ziekte van Parkinson. Het klinische fenotype dat patiënten met LRRK2 mutaties vertonen, is sterk gelijkend aan het fenotype van patiënten die lijden aan een sporadische vorm, wat zou kunnen wijzen op eenzelfde ontstaansmechanisme voor de beide vormen. Bijgevolg zou onderzoek naar de moleculaire processen, die aan de basis liggen van de genetische vormen van de ziekte van Parkinson, ook kunnen leiden naar de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor sporadische vormen.
Men heeft ontdekt dat pathogene mutaties in het LRRK2 eiwit een verhoogde kinase activiteit veroorzaken, waardoor het blokkeren van deze verhoogde activiteit met inhibitoren werd voorgesteld als mogelijke therapie. Uit verschillende studies blijkt dat LRRK2 kinase inhibitoren kunnen beschermen tegen neurodegeneratie. Dit werd reeds in celcultuur en in proefdieren aangetoond en dit zowel in modellen op basis van LRRK2 mutaties als in modellen voor de ziekte die geen veranderingen in het LRRK2-gen dragen. Hoe dan ook is enige voorzichtigheid geboden, aangezien we mogelijk nog niet alle gevolgen van LRRK2 kinase inhibitie begrijpen.

Een eerste gevolg van LRRK2 kinase inhibitie is defosforylatie van het LRRK2 eiwit. Opmerkelijk is dat defosforylatie ook een kenmerk is van pathogeen gemuteerd LRRK2 eiwit en bijgevolg betrokken zou kunnen zijn bij de pathogenese van de ziekte. Het al dan niet gefosforyleerd zijn van een eiwit, speelt vaak een cruciale rol in de signaaltransductie in een cel of tussen cellen onderling en komt tot stand door interactie met andere eiwitten. Het is van belang te weten te komen of dezelfde fosfatasen verantwoordelijk zijn voor defosforylatie van LRRK2 na kinase inhibitie en in een pathogene vorm. In het verleden werd in ons labo de katalytische subeenheid van proteïne fosfatase 1 (PP1) geïdentificeerd als fosfatase voor pathogene vormen van LRRK2 en na LRRK2 kinase inhibitie. De regulatorische eiwitten of andere fosfatasen die bij deze processen betrokken zijn, zijn nog ongekend. We beoogden in een eerste deel van dit werk de identificatie van fosfatasen of regulatorische eiwitten die betrokken zijn bij LRRK2 defosforylatie na LRRK2 kinase inhibitie. Vooreerst werd in ons laboratorium al een ‘small interfering’ (si) RNA screening uitgevoerd, waarbij gekeken werd naar de effecten op LRRK2 fosforylatie na het uitschakelen van specifieke fosfatasen of regulatorische eiwitten. In dit project willen we de meest belovende kandidaten van de siRNA screening verder bestuderen en valideren in cellen door gebruik te maken van RNA interferentie met behulp van lentivirale vector transductie. We hebben gevonden dat naast PP1, ook het proteïne fosfatase 2A (PP2A) complex betrokken is bij de defosforylatie van LRRK2, en dan vooral na LRRK2 kinase inhibitie. Verdere identificatie van het exacte fosfatasecomplex dat inwerkt op LRRK2 in pathogene vormen en na LRRK2 kinase inhibitie, kan leiden tot nieuwe therapeutische inzichten.

Daarnaast zorgt een langdurige behandeling met LRRK2 kinase inhibitoren voor een verlaging van de totale hoeveelheid LRRK2 eiwit. Dit konden we waarnemen in celcultuur, maar ook in weefsel van dieren die werden behandeld met LRRK2 kinase inhibitoren. Andere onderzoeksgroepen beschreven ook reeds dat in dieren die behandeld werden met LRRK2 kinase inhibitoren een kenmerkende longpathologie kan worden vastgesteld, die eveneens wordt waargenomen in LRRK2 knockout dieren. Bijgevolg zou deze longpathologie gelinkt kunnen zijn aan een verlaagde hoeveelheid LRRK2 eiwit. In een volgend deel van dit werk, trachtten we het onderliggende werkingsmechanisme van LRRK2 kinase inhibitor-geïnduceerde eiwit destabilisatie te identificeren. Door verschillende synthesewegen en afbraakmechanismen van eiwitten in de cel te bestuderen en/of te blokkeren, vonden we dat LRRK2 na inhibitie wordt afgebroken door het proteasomaal systeem. Daarnaast wilden we ook LRRK2 kinase inhibitor-geïnduceerde destabilisatie verder karakteriseren door na te gaan hoe verschillende pathogene mutanten van LRRK2 reageren op langdurige LRRK2 kinase inhibitie. We zagen dat niet alle pathogene mutanten van LRRK2 destabilisatie vertonen na behandeling. Merkwaardig genoeg vertonen sterk gedefosforyleerde mutanten geen verlaagde LRRK2 eiwitniveaus na inhibitie, in tegenstelling tot een slechts deels gedefosforyleerde mutant. Dit deed ons vermoeden dat de basale fosforylatieniveaus van belang kunnen zijn voor de inductie van destabilisatie. We onderzochten het belang van reeds gekende fosforylatieplaatsen door mutaties aan te brengen in LRRK2 die het (de)fosforylatieproces verhinderen. Zo vonden we dat de reeds gekende fosforylatieplaatsen niet van cruciaal belang zijn voor de inductie van destabilisatie. Caseïne kinase 1α (CK1α) werd geïdentificeerd als het kinase verantwoordelijk voor de fosforylatie van deze gekende fosforylatieplaatsen en mogelijks ook van enkele nieuwe fosforylatieplaatsen in LRRK2. Na CK1 inhibitie zagen we dat destabilisatie van LRRK2 optreedt, zowel in het wild-type LRRK2 als in zijn pathogene varianten, in de variant waarbij we de gekende fosforylatieplaatsen gemuteerd hebben en in de long van muizen. Hieruit concludeerden we dat (de)fosforylatie van enkele vooralsnog ongekende fosforylatieplaatsen, die onder invloed staan van het kinase CK1, mogelijks aan de basis liggen van de verlaging in LRRK2 eiwit niveau na LRRK2 kinase inhibitie. De volgende stap is de identificatie van deze ongekende fosforylatieplaats(en). De studie in het tweede deel van dit werk biedt nieuwe inzichten in de eiwithomeostase van LRRK2, wat eveneens bijdraagt tot een bredere kennis over de werking van LRRK2 kinase inhibitoren, één van de meest belovende potentiële therapeutische strategieën voor de ziekte van Parkinson vandaag de dag

Datum:1 jan 2015 →  13 jun 2019
Trefwoorden:Parkinson's diseases
Disciplines:Neurowetenschappen, Biologische en fysiologische psychologie, Cognitieve wetenschappen en intelligente systemen, Ontwikkelingspsychologie en veroudering
Project type:PhD project