Vorming van amyloïde (amyloïd-achtige) fibrillen uit proteïnen van wit van ei en tarwegluten onder condities die relevant zijn bij de productie van levensmiddelen

Proteïnen zijn een essentieel onderdeel van het menselijk dieet. Daarnaast leveren ze een structurele bijdrage tijdens de productie van levensmiddelen (bijvoorbeeld bij het stabiliseren van een gel of een schuim; bij het vormen van een visco-elastisch deeg). Voedingsproteïnen worden vaak onderverdeeld naar herkomst in dierlijke of plantaardige proteïnen. De proteïnen van kippenei-eiwit (EW) en tarwegluten (WG) zijn belangrijke voorbeelden van elke groep. EW heeft een hoge nutritionele waarde en wordt vaak gebruikt voor zijn schuimvormende en gelerende eigenschappen. WG zijn de meest geconsumeerde graan-proteïnen en vormen de structurele basis van vele bakkerijproducten.

De functionaliteit en de structuur van proteïnen zijn onlosmakelijk aan elkaar verbonden. Desondanks blijft het koppelen van specifieke structuren aan functionaliteiten tot op de dag van vandaag nog een grote uitdaging. Amyloïde fibrillen (AFs) zijn proteïne-structuren die gebaseerd zijn op een strikte ordening van β-platen. Dit type structuren levert specifieke functionaliteiten op die veelbelovend kunnen zijn voor toepassingen in levensmiddelen. Daarbij kan gedachte worden aan hun bijdrage tot schuim- en gelvorming. Helaas beperkt de kennis omtrent de vorming van amyloïde fibrillen van EW en WG zich tot condities die niet bruikbaar zijn voor de productie van levensmiddelen (bijvoorbeeld in zeer zure condities of over lange incubatieperiodes).

In dit doctoraatsonderzoek wordt bestudeerd of en hoe de proteïnen van EW en WG fibrillen kunnen vormen onder condities die relevant zijn voor de productie van levensmiddelen. Hierbij worden volgende onderzoeksvragen gesteld:

welke invloed heeft drogen op de fibrilvorming van EW en WG proteïnen,

in welke mate beïnvloeden hydrothermale behandelingen de fibrilvorming van EW- en WG-proteïnen,

n welke mate kan enzymatische hydrolyse de fibrilvorming van WG-proteïnen verbeteren, en

in welke mate beïnvloedt het toevoegen van beperkte hoeveelheden chaotropische of enzymatische agentia de extractie van proteïnefibrillen uit verhit EW en WG.

In een EERSTE DEEL werd de invloed van verhittingscondities vergelijkbaar met slow cooking (78 °C, 22 h) of koken op EW fibrilvorming bestudeerd. Beide types van verhitting, maar vooral de slow cooking-condities, stimuleerden de vorming van fibrillen van ovalbumine (OVA; het meest voorkomende, wateroplosbare proteïne van EW). Media met natriumdodecylsulfaat (SDS) en dithiothreitol (DTT) (samen of apart) bleken niet geschikt voor de extractie van proteïnefibrillen uit gels van gekookt EW (15 min). Een procedure werd daarom ontwikkeld voor de extractie van proteïnefibrillen van gekookt EW met het enzym proteïnase K. Een behandeling met proteïnase K (37 °C, 48 h, 150 rpm) van gekookt EW zorgde voor het vrijzetten van hoofdzakelijk amorfe aggregaten. Na centrifugeren werd uit de pellet een dens netwerk van wormvormige proteïnestructuren geëxtraheerd met 0,01 M HCl (kamer-temperatuur, 1 h, 150 rpm). Dit werd vastgesteld met transmissie-elektronen-microscopie (TEM). Fouriertransformatie infraroodspectroscopie (FTIR), X-stralendiffractie en groene, dubbele lichtbreking na kleuring met Congorood bevestigden de aanwezigheid van AFs in deze pellets. Ongeveer 1,5−3,0% van de proteïnen in EW vormen AFs tijdens koken. Daarnaast werd ook voor verhit OVA (78 °C, 22 h) aangetoond dat er AFs in het staal aanwezig waren, hiervoor werd een incubatie met trypsine (37 °C, 48 h, 150 rpm) gebruikt. De ontwikkelde enzym-gebaseerde extractiemethode en de genoemde analytische technieken werden verder gebruikt om de vorming van AF te bestuderen onder condities die relevant zijn voor de productie van levensmiddelen.

EW-poeders worden vaak gebruikt in de levensmiddelenindustrie. In het TWEEDE DEEL werd de invloed van droogstappen en hydrothermale behandelingen op fibrilvorming in oplossingen van gedroogd EW onderzocht. Drogen beïnvloedt de fibrilvorming van EW- proteïnen, waarbij sproeidrogen in belangrijkere mate het proces bevordert dan vriesdrogen. De bijkomende invloed van specifieke dry heating-condities [opslag voor één week bij 50 °C en 50% relatieve vochtigheid (RH) (EWSD 50°C/50%) of bij 60 °C en 80% RH (EWSD 60°C/80%)] op de fibrilvorming van gesproeidroogde EW-proteïnen (EWSD) was beperkt. Een response surface design liet toe de optimale condities voor fibrilvorming van oplossingen van gevriesdroogde OVA en EW (OVAFD en EWFD) te bepalen. Deze condities blijken respectievelijk 2,0% (wproteïne/v), pH 7,0, 23 h, 76 °C en 0,5% (wproteïne/v), pH 7,0, 24 h, 85 °C, te zijn. Onder deze condities bevatten OVAFD-oplossingen een hoger gehalte β-plaatstructuren en ook grotere, worm-vormige aggregaten dan oplossingen van EWFD. Een hoger gehalte aan fibrillen werd gevonden voor verhitte EWSD 60°C/80%-dispersies [0,5% (wproteïne/v), pH 7,0, 24 h, 85 °C] dan voor verhitte EWSD 50°C/50%-dispersies, wat toch een zekere impact van verschillende dry heating-condities aantoonde.

In het DERDE DEEL werd de fibrilvorming van WG-proteïnen bestudeerd onder de verhittings-condities die geschikt bleken voor fibrilvorming van EW. Stalen van onverhitte en verhitte WG-stalen werden behandeld met proteïnase K en trypsine (37 °C, 48 h, 150 rpm) om de niet-fibrillaire structuren op te lossen. Uit de neerslag werden fibrillaire proteïnestructuren geëxtraheerd met 0,05 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,0). Onverhitte WG-dispersies bevatten reeds enkele fibrillen, vermoedelijk als resultaat van de industriële bewerkingen (droogstappen) tijdens het opzuiveringsproces. Verhitten zorgde voor een stijging van het gehalte aan fibrillen. Verhitten van WG-dispersies bij 78 °C voor 22 h zorgde voor vorming van rechte fibrillen (ca. 700 nm lang), terwijl koken van WG voor minstens 15 min zorgde voor langere (ca. 1 to 2 μm) maar tevens rechte fibrillen. Deze stalen toonden de typische groene, dubbele lichtbreking na kleuring met Congorood. Het X-stralendiffractiepatroon toonde een typische reflectie (4,7 Å) voor inter-β-strengafstanden en twee zwakkere reflecties bij 7,8 Å en 12,1 Å. Deze laatste wijst zeer waarschijnlijk op de afstand tussen gestapelde b-platen (i.e. 10 Å). Deze resultaten, in combinatie met deze van FTIR bevestigden de identificatie van β-rijke “amyloid-like” fibrillen (ALFs) in gekookte dispersies van WG. Ongeveer 0,1% tot 0,5% van de WG-proteïnen ordent zich in ALFs tijdens koken gedurende 15 min.

In het VIERDE DEEL werd de vorming van ALFs uit tarweglutenpeptiden (WGPs) onderzocht bij verschillende hydrothermale behandelingen. Als eerste werd de fibrilvorming voor trypsine-WGP [hydrolysegraad 2,0% (DH 2) or 6,0% (DH 6)] onder hydrothermale condities geoptimaliseerd door gebruik te maken van een response surface design. DH 6 WGPs toonden een hogere neiging om fibrillen te vormen dan DH 2 WGPs. Verhitten van DH 6 WGPs aan 2,0% (w/v) voor 38 h bij 85 °C en pH 7,0 resulteerde in optimale fibrilvorming. Als tweede werden trypsine, chymotrypsine, thermolysine, papaïne en proteïnase K individueel toegevoegd om verschillende WGP stalen te produceren met DH 6. Na inactivering van het enzym en daar-opvolgende verhitting bij de optimale fibrilvormingscondities, maakten chymotrypsine- en proteïnase K- behandeld DH 6 WGPs kleine, wormvormige fibrillen aan, terwijl de fibrillen van trypsine DH 6 WGPs lang (ca. 500 nm tot 1,3 μm) en recht waren. De gemiddelde peptidelengte en de oppervlaktehydrofobiciteit van de peptide bleken bepalend voor de fibrilvorming. Een voorbeeld is dat hitte-geïnduceerde fibrilvorming meer voorkomt bij trypsine-behandelde WGPs, deze hebben gemiddeld langere peptiden met een hoge hydrofobiciteit dan de andere geproduceerde peptiden. Als derde werden tryptische peptiden gemaakt van de afzonderlijke fracties van WG, namelijk gliadine en glutenine. Beide fracties vormden wormvormige structuren. Omdat zowel de morfologie als de grootte van de fibrillen niet overeenkwam met deze van de fibrillen van trypsine-behandelde WGPs, wordt aangenomen dat beide WG-proteïnefracties bijdragen tot de fibrilvorming van WGPs.

Kort samengevat: dit proefschrift toont aan dat ALFs of zelfs AFs gevormd worden uit EW- en WG-proteïnen onder condities die relevant zijn voor de productie van levensmiddelen. Dit suggereert de aanwezigheid van AFs in het menselijk dieet. Daarnaast leverde dit doctoraatsonderzoek een enzym-gebaseerde extractiemethode op die verder onderzoek naar AFs in complexe voedingssystemen mogelijk maakt. Er wordt verwacht dat ALFs of zelfs AFs gevormd onder condities die relevant zijn voor de productie van levensmiddelen op basis van hun specifieke techno-functionele eigenschappen kunnen bijdragen tot de kwaliteit van levensmiddelen.