Ontwikkeling van Pept-Ins voor in vivo beeldvorming.

Experimentele data toonden aan dat de amyloïde aggregatie van eiwitten wordt veroorzaakt door korte eiwit regio’s vatbaar voor aggregatie (Aggregation Prone Regions, APRs) die aanwezig zijn in eiwit sequenties. Deze APRs kunnen met andere eiwit regio’s van dezelfde sequentie interageren om zo de karakteristieke cross-β sheet gestructureerde ruggengraat van amyloïde eiwitten te vormen. Deze APRs bestaan doorgaans uit 5-15 aminozuren en bevatten vooral hydrofobe aminozuren met een kleine netto lading. Deze APRs zijn aanwezig in de grote meerderheid van eiwitten die voorkomen in de natuur, vaak begraven in de hydrofobe kern van gevouwen eiwitten. Wanneer APRs toch blootgesteld worden aan het omgevende solvent, dan interageren ze met eiwit regio’s van dezelfde sequentie wat resulteert in de vorming van β-sheet gestructureerde eiwit aggregaten. Het toevoegen van niet-homologe eiwit sequenties in de dens gepakte opeenstapeling van identieke aminozuren, wordt sterisch verhinderd. Eiwitten aggregeren dus normaal hoofdzakelijk met identieke eiwitten, omwille van deze sequentie-specifieke amyloïde aggregatie. De neiging van een bepaald eiwit segment tot dit soort aggregatie kan bepaald worden door APR-voorspellende computer algoritmen, zoals het TANGO algoritme.

Eerder werd vastgesteld dat APRs kunnen gebruikt worden om synthetische amyloïde peptiden te ontwikkelen die Pept-insTM genoemd worden. Pept-in staat voor “Peptide Interferor” en Pept-ins hebben een maximale lengte van ongeveer twintig aminozuren. Pept-in sequenties worden afgeleid van APRs aanwezig in een doelwit eiwit, die worden geïdentificeerd door het TANGO algoritme. In plaats van een ligand-receptor of epitoop-antilichaam binding, interageren Pept-ins op basis van de APR via een specifieke β-sheet aggregatie interactie met hun doelwit eiwit, dat ook deze APR bevat. Pept-ins zijn in het verleden bestudeerd geweest voor doelwit-specifieke inhibitie, door middel van het induceren van de aggregatie van het doelwit eiwit. Dit heeft belangrijke agriculturele en therapeutische implicaties in planten, prokaryoten en eukaryoten en in vitro detectie toepassingen. In deze Doctoraatsthesis werd het potentieel van Pept-ins onderzocht voor in vivo diagnostische beeldvorming. Meer bepaald werd het gebruik van met positron emitters gemerkte Pept-ins voor positron emissie tomografie (PET) beeldvorming van kanker en infectie geëvalueerd. Radionuclide beeldvorming zoals PET maakt niet-invasieve beeldvorming van biologische processen en ziekten mogelijk, gebruik makende van de hoge affiniteit en selectiviteit interactie van radioactief gemerkte moleculen met hun doelwit in vivo. 

Radioactief gemerkt vascin, [68Ga]Ga-NODAGA-PEG4-vascin, en P2, [68Ga]Ga-NODAGA-PEG2-P2, werden geëvalueerd als speurstoffen voor PET beeldvorming van kanker en infectie, respectievelijk, en toonden een goed doelwit-versus-achtergrond contrast in de PET scans. Vascin interageert met VEGFR2, een receptor die belangrijk is in tumor angiogenese, en P2 veroorzaakt een vernietigende aggregatie cascade in E. coli. Er werd aangetoond dat beide Pept-ins specifiek accumuleerden in vivo in hun doelwit weefsel, wat kon ongedaan gemaakt worden door aminozuren in de Pept-in APR te muteren naar proline, een aminozuur ongeschikt voor inbouw in een β-sheet structuur. Deze data wijzen erop dat de geobserveerde in vivo specificiteit wordt veroorzaakt via Pept-in APR-gebaseerde interactie met het doelwit eiwit, en benadrukt het belang van de specifieke opbouw van Pept-ins. Om uit te sluiten dat de geobserveerde in vivo accumulatie gebeurt door aspecifieke accumulatie van aggregaten van Pept-ins via het verhoogde permeabiliteit en retentie effect (EPR effect), werden er cross-validatie experimenten uitgevoerd. Wanneer radioactief gemerkt P2 geïnjecteerd werd in het muis melanoma tumor model van vascin, dan werd er geen tumor accumulatie waargenomen. In een gelijkaardig experiment waarbij radioactief gemerkt vascin werd geïnjecteerd in het P2 muis E.coli spier infectie model, werd er geen specifieke accumulatie waargenomen in geïnfecteerd weefsel. Farmacokinetische studies toonden een snelle klaring van radioactief gemerkt vascin en P2 uit gezond weefsel.

De veelbelovende in vivo specificiteit en farmacokinetiek van radioactief gemerkte Pept-ins, geobserveerd in dit werk in twee verschillende ziekte modellen, tonen het grote potentieel van een platform gebaseerd op deze technologie voor diagnostische applicaties. De Pept-in aminozuur sequentie is gebaseerd op APRs uit het doelwit eiwit, geïdentificeerd via het TANGO algoritme, wat een “rational drug design approach” toelaat. Doelwit-specifieke APRs zijn aanwezig in de meerderheid van natuurlijk voorkomende eiwitten, en daarom vertoont een Pept-in-gebaseerd platform een potentieel generiek karakter, gelijkaardig aan antilichamen en afgeleide varianten. Pept-ins worden geproduceerd door middel van chemische vastefase-synthese, een eenvoudige en snelle methode met lage productie kost en hoge verwerkingscapaciteit. Zowel vascin als P2 interageren met hun doelwit in de intracellulaire omgeving, en op deze manier wordt het arsenaal aan mogelijke beeldvorming doelwitten aanzienlijk uitgebreid voorbij de extracellulaire doelwitten van andere peptiden, antilichamen en antilichaam derivaten.

PET beeldvorming met radioactief gemerkt vascin vertoonde persistente accumulatie in de tumor over de 3-uur durende scan. Hierdoor heeft radioactief gemerkt vascin potentieel voor kanker PET beeldvorming in patiënten. PET met radioactief gemerkt P2 maakte een duidelijk onderscheid tussen bacteriële infectie en steriele inflammatie. De aanhoudend hoge accumulatie van vascin in tumor weefsel, suggereert dat Pept-ins gemerkt met radionucliden die α- of β-partikels uitzenden ook mogelijke toepassing hebben voor tumor radionuclide therapie.