Ontwikkeling en toepassing van 'reverse genetics' filovirus-systemen voor het screenen van virusremmers

Filovirussen zijn een snelgroeiende groep van menselijke pathogenen die ernstige ziekte met een hoog sterftecijfer kunnen veroorzaken. Verschillende leden van de familie Filoviridae kunnen ziekte veroorzaken, maar de meeste uitbraken in de afgelopen vijf decennia waren toe te schrijven aan het welgekende ebolavirus en aan marburgvirus, het eerste ontdekte filovirus. Behandelingsopties voor de ziektes veroorzaakt door deze virussen zijn beperkt en bij een gebrek aan effectieve therapieën grotendeels gericht op vroege ondersteunende zorg en symptomatische behandeling. Omdat het hoge risico dat gepaard gaat met onderzoek naar ebola- en marburgvirussen het gebruik van een bioveiligheidsniveau-4 faciliteit vereist om replicatiecompetente virussen te bestuderen, is het meeste onderzoek naar mogelijke virusremmers uitgevoerd met niet-infectieuze alternatieven. Vooral voor het marburgvirus is de variëteit in beschikbare systemen echter zeer beperkt, wat de mogelijkheden voor wetenschappelijke vooruitgang belemmert. Het primaire doel van het hier gepresenteerde werk was daarom het ontwikkelen van nieuwe virusalternatieven voor het marburgvirus om de kloof met het ebolavirus te helpen dichten. Daarnaast wilden we de nieuwe systemen optimaliseren voor gebruik in de zoektocht naar virusremmers en ze vervolgens dan ook gebruiken om nieuwe filovirusremmers te identificeren, zowel voor het marburgvirus als voor het ebolavirus. Een eerste virusalternatief dat werd ontwikkeld, is een nieuw marburgvirus-minigenoomsysteem dat wordt gereguleerd door het natief tot expressie gebrachte RNA-polymerase II, in tegenstelling tot alle bestaande systemen, die worden gecontroleerd door het exogene T7-polymerase. We illustreren hier enkele kenmerken van dit nieuwe systeem en tonen de bruikbaarheid in verschillende cellijnen aan. Daarnaast demonstreren we ook het nut van deze nieuwe tool voor het screenen van mogelijke virusremmers en bespreken we het toegevoegde voordeel ten opzichte van bestaande systemen. Hoewel dit nieuwe systeem een interessante toevoeging is aan het repertoire van beschikbare marburgvirusalternatieven, maken de inherente beperkingen van minigenoomsystemen nog steeds de beschikbaarheid van aanvullende onderzoekshulpmiddelen noodzakelijk om een meer uitgebreide studie van filovirussen mogelijk te maken. Daarom hebben we ook een geavanceerder systeem ontwikkeld dat gebruik maakt van een biologisch ingeperkt marburgvirus. Door een cellijn te creëren die een van de essentiële virusgenen constitutief tot expressie brengt en tegelijkertijd dit gen uit het virusgenoom te verwijderen, kan een recombinant virus worden gemaakt dat veilig te hanteren is omdat het zich niet in reguliere cellen kan vermenigvuldigen. Omgekeerd, in de specifieke cellijn die het ontbrekende gen tot expressie brengt, ervaart dit virus een bijna normale replicatiecyclus, waardoor bijna alle aspecten van de levenscyclus van het virus kunnen worden bestudeerd. Terwijl biologische inperking al gekend was mogelijk te zijn voor het ebolavirus, laten we hier zien dat met de juiste aanpassingen en optimalisaties ook vergelijkbare systemen kunnen worden gemaakt voor andere filovirussen. Daarnaast beschrijven we de optimalisatie en validatie van het resulterende biologisch ingesloten marburgvirussysteem en een equivalent ebolavirussysteem als hulpmiddelen voor het screenen van verbindingen aan hoge capaciteit. Ten slotte hebben we onze nieuw ontwikkelde systemen gebruikt om bijna 5.000 verbindingen te screenen op hun antivirale activiteit, wat resulteerde in de identificatie van verschillende verbindingen die een sterke selectiviteit vertonen voor virusremming en die interessante aanknopingspunten vormen voor de ontwikkeling van nieuwe filovirus antivirale therapieën.