< Terug naar vorige pagina

Project

Ontrafeling van de biosynthese van een polyketide-antibioticum uit Serratia plymuthica stam RVH1.

Dit doctoraatsonderzoek was gericht op de structurele, functionele en genetische karakterisering van de antimicrobiële metabolieten geproduceerd door Serratia plymuthica stam RVH1. Daarnaast werden ook belangrijke inzichten verworven in de biosynthese van deze antibiotica en werden resistentieontwikkeling  en bestaande resistentiemechanismen onderzocht. Na opzuivering en structuurbepaling van de antimicrobiële metabolieten, werd vastgesteld dat S. plymuthica RVH1 de breed-spectrum zeamine-antibiotica produceert: een bijzondere klasse van hybride polyamino–polyketide-peptide natuurlijke producten. De zeamine-antibiotica werden initieel verondersteld een mengsel te zijn van drie nauw verwante componenten: zeamine en zeamine II (eerder reeds geïdentificeerd als metabolieten van de fytopathogeen Dickeya zeae), alsook zeamine I (een nieuw ontdekt analoog). Achtvoudig-hogere concentraties van zeamine II zijn vereist om de groei van Staphylococcus aureus ATCC27661 (MIC = 32 Ýg/ml) en Escherichia coli MG1655 (MIC = 64 Ýg/ml) te inhiberen, in vergelijking met zeamine en zeamine I. De MBC/MIC verhouding van 2 wijst er dan weer op dat de zeamine-antibiotica bacteriocidaal zijn. Naast antimicrobiële activiteit, vertonen de zeamines ook sterke cytostatische activiteit tegen menselijke en murine kankercellijnen met IC50-waarden die tussen 1.7 en 4.1 μM gelegen zijn.

Onderzoek naar hun werkingsmechanisme en cellulair doelwit bracht aan het licht dat zeamine, zeamine I en zeamine II de integriteit van celmembranen verstoren. De antibiotica induceren een snelle en concentratie-afhankelijke efflux van carboxyfluoresceïne uit kleine, unilamellaire vesikels van verschillende fosfolipidesamenstelling en dit met een hogere selectiviteit voor bacteriële dan voor eukaryote modelmembranen. Dit wijst er op dat de zeamines rechtstreeks kunnen interageren met de membraan zelf, zonder de tussenkomst van specifieke receptoren. De biosyntheseprocessen van DNA, RNA, vetzuren en eiwitten vallen snel en gelijktijdig stil in E. coli en S. aureus wanneer deze cellen worden blootgesteld aan sub-inhibitorische zeamine concentraties. Dit is vermoedelijk een rechtstreeks gevolg van membraandisruptie. De zeamine-antibiotica zijn ook in staat de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën te permeabiliseren, zoals blijkt uit de concentratie-afhankelijke opname van kleine hydrofobe moleculen zoals 1-N-fenylnaftylamine. Het valine-polyketidedeel van zeamine en zeamine I blijkt de efficiëntie van deze permeabilisatie te verhogen. Grotere hydrofiele fluorescente eiwitten daarentegen, waren niet in staat om de buitenmembraan te passeren in de aanwezigheid van de zeamine-antibiotica. Dit doet vermoeden dat de zeamines eerder subtiel de buitenmembraan verstoren en geen ingrijpende veranderingen of grote porievorming teweegbrengen. Continue microscopie-opnames in de tijd toonden aan dat bij hoge inhibitorische concentraties van de zeamines, membraanlysis optreedt. Bovenstaande resultaten doen dus vermoeden dat de breed-spectrum zeamine-antibiotica bacteriën afdoden door hun membraan te verstoren, een activiteit die waarschijnlijk steunt op rechtstreekse hydrofobe en elektrostatische interacties met respectievelijk hydrofobe en negatief-geladen membraancomponenten.

Om na te gaan hoe snel zeamineresistentie kan optreden, werden vijf onafhankelijke S. aureus Newman stammen serieel blootgesteld aan sub-inhibitorische concentraties van de antibiotica. Er werden geen mutanten met een verlaagde gevoeligheid aan de zeamines verkregen. Dit wijst erop dat resistentieontwikkeling tegen de zeamines via genomische mutaties onwaarschijnlijk is. In een zoektocht naar bestaande resistentiemechanismen, werd het genoom van Serratia proteamaculans LMG7884 onder de loep genomen. Deze stam vertoont namelijk een hogere intrinsieke resistentie tegen de zeamines. Eén bepaald locus bleek te coderen voor een vermoedelijk GCN5-achtig N-acetyltransferase dat een achtvoudige verhoging van de MIC van de zeamines tegen S. proteamaculans DSM4543 induceert.

Via een gecombineerde aanpak die random transposon mutagenese, genomische BAC-bank screening en gerichte gendeleties omvatte, kon de zeamine gencluster (50 kb, zmn5, zmn9-22) afgebakend worden in het genoom van S. plymuthica RVH1. Deze cluster is geconserveerd in het genoom van verschillende andere Enterobacteriën en is vermoedelijk verworven door S. plymuthica RVH1 via horizontale gentransfer. Naast post-assemblage modificerende enzymen en export-gerelateerde eiwitten, coderen de genen in de zeamine gencluster ook voor twee afzonderlijke assemblagelijnen: een iteratief type I vetzuursynthase (FAS)/polyketidesynthase (PKS) dat homologie vertoont met poly-onverzadigde vetzuursynthasen, en een hybride niet-ribosomaal peptidesynthetase (NRPS)/PKS systeem. Aan de hand van gerichte gendeleties, hoge resolutie LC-MS(/MS) analyses, in vitro biochemische assays en studies met extern toegevoegde precursoren, werd de biosyntheseweg van de zeamines in kaart gebracht. De penta-amino-hydroxy-alkylketen wordt gesynthetiseerd door de multi-domein FAS/PKS assemblagelijn Zmn10-13. Zmn14 is een vrijstaand NADH-afhankelijk thioester reductase dat waarschijnlijk een tetra-amino-hydroxy-alkylthioester reductief vrijzet als een aldehyde. Ondanks het intrinsiek vermogen van Zmn14 om aldehyden verder te reduceren tot alcoholen, wordt het gevormde aldehyde-intermediair vermoedelijk preferentieel getransamineerd ter vorming van zeamine II. In een parallelle biosyntheseweg worden hexapeptide-monoketide en hexapeptide-diketide thioesters geproduceerd door het hybride NRPS/PKS gevormd door Zmn16-18. Deze intermediairen worden vervolgens aan zeamine II gekoppeld door het vrijstaand condensatiedomein Zmn19. De gevormde prezeamines, evenzeer behorend tot het zeamine-antibioticacomplex, werden structureel gekarakteriseerd en geïdentificeerd als precursoren van zeamine en zeamine I. De prezeamines worden gedeeltelijk omgezet naar zeamine en zeamine I door Znm22, een acylpeptide hydrolase dat een N-terminaal pentapeptide afsplitst in een post-assemblage proteolytische reactie. Kortom, de zeamine-antibiotica worden geassembleerd door een unieke combinatie van NRPS, type I modulaire PKS en poly-onverzadigde vetzuursynthase-achtige multi-enzymcomplexen. Deze ongewone biosyntheseweg kan een waardevolle bijdrage leveren op het gebied van synthetische biologie met het oog op combinatoriële biosynthese en rationeel ontwerp van nieuwe bioactieve componenten. Daarnaast levert het belangrijke inzichten op in atypische ketenterminatiemechanismen  van type I PKS and poly-onverzadigde vetzuursynthasen en vergroot het onze kennis en begrip van secundaire vetzuurbiosynthese.

Datum:1 okt 2009 →  31 mrt 2015
Trefwoorden:Serratia plymuthica
Disciplines:Biochemie en metabolisme, Medische biochemie en metabolisme, Microbiologie, Systeembiologie, Laboratoriumgeneeskunde
Project type:PhD project