< Terug naar vorige pagina

Project

Onderzoek naar de rol van oligodendrocyten die gemuteerd "fused in sacroma" bevatten in de pathofysiologie van amyotrofische laterale sclerose door gebruik te maken van geinduceerde pluripotente stamcellen.

Amyotrofe laterale sclerose (ALS) is een neurodegeneratieve ziekte waarbij zowel de bovenste als de onderste motorneuronen afsterven, wat leidt tot verlamming en uiteindelijk sterfte 2-3 jaar na het ontstaan van de symptomen. Naast motor neuronen, zijn gliale cellen ook betrokken in de ziekte omdat hun ondersteunende functie naar neuronen is aangetast. In 10% van de gevallen is de ziekte familiaal en wordt ze veroorzaakt door genetische mutaties, waarvan de meest frequent gemuteerde genen C9ORF72, SOD1, TARDBP en FUS zijn. Omdat er nog geen genezing mogelijk is voor ALS, zijn ziekte modellen, zowel in vivo als in vitro, nodig om onderliggende causale mechanismen te ontdekken die de motorneuron sterfte veroorzaken. In deze thesis worden geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) gebruikt om een ALS model op te zetten in een humane context. Andere studies hebben reeds motorneuronen gegenereerd afkomstig van iPSCs van ALS patiënten die typische kenmerken van de ziekte recapituleren zoals de aanwezigheid van oxidatieve stress, proteïne aggregaten en defecten in axonaal transport. Om ook de rol van gliale cellen in ALS te onderzoeken, zijn oligodendrocyten en astrocyten reeds gegenereerd van iPSCs, maar deze studies gebruikten geen isogene controles en onderzochten niet het effect van de FUS mutatie in deze gliale cellen. Daarom worden in deze thesis FUS mutante iPSCs met hun corresponderende isogene controle gebruikt om vervolgens te differentiëren naar oligodendrocyten en astrocyten om hun rol in de ziekte ALS te bepalen.

Eerst, werd een nieuw protocol geoptimaliseerd om astrocyten te genereren van pluripotente stamcellen via de overexpressie van de transcriptiefactor SOX9. Deze SOX9-astrocyten vertoonden functionele eigenschappen zoals glutamaat opname, cytokine secretie en het ondersteunen van neuronale functies. Daarna, werden de FUS mutante iPSCs gedifferentieerd naar astrocyten, met behulp van bovenvermeld protocol, en naar oligodendrocyten, met behulp van een bestaand protocol gebaseerd op SOX10 overexpressie. Voordat differentiatie mogelijk is, werd het genoom van de FUS mutante iPSCs aangepast zodat ze SOX9 of SOX10 geïntegreerd hebben in de veilige AAVS1 locus zodat de transcriptiefactor tot overexpressie kan worden gebracht na blootstelling aan doxycycline. Ook werd er via de techniek “base editing” de FUS-P525L mutatie in ‘gezonde’ iPSCs aangebracht om zo een isogeen paar te creëren. Naast de FUS-P525L mutante iPSCs, werden in deze studie FUS-R521H mutante iPSCs van een ALS patiënt gebruikt, ook met zijn corresponderende isogene controle. Beide isogene iPSC paren konden differentiëren naar zowel astrocyten als oligodendrocyten. In de FUS-P525L astrocyten en oligodendrocyten was cytoplasmatische mislocalisatie van het FUS proteïne zichtbaar, een fenotype dat ook aanwezig is in ALS patiënten met een FUS mutatie. Transcriptoom analyse van de FUS-R521H mutante cellen suggereerde de aanwezigheid van ER stress en een effect op lipiden metabolisme door de FUS mutatie. Na validatie experimenten, bleek ER stress niet prominent aanwezig te zijn in de FUS mutante gliale cellen. Lipidomic analyse toonde wel een verminderd aantal lipiden aan in de mutante oligodendrocyten, maar niet in astrocyten, wat zou kunnen leiden tot een aangetaste myeline productie in oligodendrocyten.

In conclusie, via transcriptiefactor-gebaseerde differentiatie werden oligodendrocyten en astrocyten gegenereerd om de rol van gliale cellen in FUS-gerelateerde ALS te onderzoeken. Preliminaire data suggereert een effect op het lipiden metabolisme in FUS mutante oligodendrocyten wat mogelijks zou kunnen bijdragen aan motorneuron degeneratie in ALS.

Datum:1 sep 2017 →  31 dec 2021
Trefwoorden:Amyotrophic lateral sclerosis, Oligodendrocytes, amyotrophic lateral sclerosis, oligodendrocytes
Disciplines:Genetica, Systeembiologie, Moleculaire en celbiologie
Project type:PhD project