Nucleic acids analysis with a biological nanopore

Het transport van nucleïnezuren door nanoschaal poriën is een belangrijk biologisch proces dat in alle levende cellen voorkomt en een sterke belangstelling heeft omwille van de vele mogelijke toepassingen zoals snelle en goedkope DNA sequentiebepaling. Nanoporie-gebaseerde sensoren zijn aantrekkelijke hulpmiddelen voor goedkope en hoge doorvoer nucleïnezuur analyse op single-molecule niveau. Wanneer een nanoporie in een artificieel lipidemembraan ingebracht wordt, in een waterige oplossing en onder een elektrische potentiaal, worden ionen door de porie geleid, die een ionische stroom genereren. Nucleïnezuren kunnen in de porie gaan en een karakteristieke stroom genereren die gebruikt kan worden voor hun identificatie. De biologische nanoporiën Alpha hemolysin en Porin A werden reeds uitvoerig gebruikt voor DNA analyses. Hun kleine binnenste lumen (<1.5 nm), laat echter enkel de translocatie van enkelstrengige (ssDNA) moleculen toe. Het toelaten van dubbelstrengig DNA (dsDNA) translocatie met biologische nanoporiën is van bijzonder belang voor de ontwikkeling van directe genomische toepassingen zoals DNA mapping. In dit onderzoek gebruikten we de Cytolysin A (ClyA) nanoporie als een biosensor voor de analyse van nucleïnezuren. De binnenste constrictie van ClyA (~4 nm) is groot genoeg voor de translocatie van zowel enkel- als dubbelstrengige DNA moleculen. We demonstreerden DNA translocatie door de ClyA nanoporie bij hoge zoutconcentratie (2.5 M NaCl). We ontdekten dat bij deze conditie dsDNA moleculen permanent gevangen konden worden in de ClyA porie, terwijl ssDNA slechts transiënt gevangen wordt. We gebruikten deze bevindingen om de nanoporie om te bouwen tot een nanomachine, die een specifiek DNA molecule kon herkennen en selectief transporteren over een biologisch membraan. In een andere implementatie werden ClyA poriën gemanipuleerd om DNA ook bij lagere ionische sterkte te transloceren door de porie. DNA translocatie bij fysiologische zoutconcentratie kan voordelig zijn voor het onderzoeken van geneesmiddelen of biomerkers die enkel specifiek binden aan DNA  moleculen in lage zout condities. De resulterende ClyA variant toonde translocatie en single-molecule detectie van zowel ssDNA als dsDNA moleculen bij fysiologische zoutconcentraties (0.15 M NaCl). De resultaten bekomen in deze thesis beschrijven de elektrostatische en entropische bijdragen die het transport van DNA moleculen door de biologische nanoporie ClyA reguleren en kunnen bijdragen tot de verdere ontwikkeling van nanoporie-gebaseerde biosensoren voor de analyse van nucleïnezuren.