< Terug naar vorige pagina
Project
Nucleaire import van HIV als doelwit voor nieuwe antivirale therapie
De HIV-replicatie cyclus is een ingewikkeld samenspel tussen virale en cellulaire eiwitten. De interacties tussen HIV-eiwitten en hun cellulaire cofactoren, zijn potentiële nieuwe doelwitten voor HIV therapie. Onze onderzoeksgroep is geïnteresseerd in de identificatie en validatie van cellulaire cofactoren van HIV integrase (IN). Een van deze cellulaire cofactoren is transportine-SR2 (TRN-SR2, TNPO3, transportine-3 ). We ontdekten TRN-SR2 in 2008 in een gist twee-hybride screen met HIV IN als aas en valideerden het als de nucleaire import factor van HIV. Hoewel TRN-SR2werd geïdentificeerd als een interactie partner van HIV IN, werd er alsalternatief voorgesteld dat TRN-SR2 zijn rol uitoefent door een interactie met het virale capside (CA) eiwit. Een CA mutant (N74D) maakt HIV namelijk onafhankelijk van TRN-SR2, onder bepaalde experimentele condities. Verschillende groepen hebben bevestigd dat TRN-SR2 knockdown de nucleaire import van HIV vermindert, maar het exacte mechanisme is nog steeds controversieel. In dit werk hebben we de rol van TRN-SR2 tijdens HIV replicatie bestudeerd.
We hebben ons gericht op de volgende doelstellingen:
(1) Inzicht krijgen in de werking van de N74D CA mutantop de TRN-SR2 afhankelijkheid,
(2) Het identificeren van de interactie interface van de IN/TRN-SR2 interactie en
(3) Het bestuderen van het effect van IN/TRN-SR2 interactie mutanten op HIV-replicatie.
Het effect van de N74D capside mutant op de TRN-SR2 afhankelijkheid</>
Omdat de N74D capside mutant, ongevoelig bleek voor TRN-SR2 knockdown, werd CA voorgesteld als de belangrijkste determinant van TRN-SR2 gemedieerde nucleaire import. Het eerste deel van mijn project bestond dus uit het bestuderen van deze N74D capside mutant en zijn rol in de nucleaire import in combinatie met TRN-SR2. Bij het bestuderen van de HIV-1N74D capside mutant in cellen gedepleteerd voor transportine-SR2, kon ik bevestigen dat het enkel onafhankelijk is van TRN-SR2, wanneer gepseudotypeerd met de vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne. Anderzijds vereist een N74D mutant virus capside die de wildtype HIV-1 envelope draagt, zij het wat minder dan wild type virus, nog steeds TRN-SR2 voor efficiënte replicatie. Door het pseudotyperen van WT en N74D mutante vectoren met enveloppen die pH-onafhankelijke virale opname bemiddelen (zoals HIV-1, mazelenvirus en amfotrope MLV enveloppen), kon ik aantonen dat HIV-1 N74D capside mutante virussen nog steeds afhankelijk zijn van TRN-SR2, terwijl het pseudotyperen met enveloppen die pH-afhankelijke endocytose bemiddelen (zoals het VSVG en Ebola virus enveloppen), het capside N74D mutant ongevoelig maken voor TRN-SR2 depletie. We hebben dus een rechtstreeks verband geïdentificeerd tussen de virale entry van HIV en zijn interactie met TRN-SR2. Onze hypothese is dat door een rol te spelen in uncoating, trafficking en/of docking, stappen die de specifieke interactie tussen IN en
TRN-SR2 voorafgaan, CA een indirect effect kan uitoefenen op het proces van nucleaire import.
Identificatie van de interface van de HIV-1 Integrase/Transportin-SR2 interactie</>
In een eerste stap in het begrijpen van de precieze rol van de IN/TRN-SR2 interactie, bestudeerde ik de interactie interface tussen HIV IN en TRN-SR2. Ik deed dit door een peptide gebaseerde benadering toe te passen, omde interactie hot spots van beide eiwitten te identificeren. Ik heb zowel IN en TRN-SR2 tot peptiden versneden en deze peptiden gebruikt om de cruciale aminozuren verantwoordelijk voor de interactie te identificeren. Ik identificeerde een reeks aminozuren in de CCD IN170-191 en twee reeksen aminozuren IN214-229 en IN259-274 in het CTD van IN. Door plaatsgerichte mutagenese, eerst in peptidesequenties en vandaar in full-length IN, identificeerde ik aminozuren die essentieel zijn voor de interactie. F185/K186/R187/K188 bepalen de interactie in de CCD terwijl R262/R263/K264 en K266/R269 hot spots zijn in de CTD van IN. Door het ontledenvan TRN-SR2 in korte structurele fragmenten werden vijf peptiden geïdentificeerd die de mogelijkheid tot interactie met IN behouden; TRN24-40, TRN56-74, TRN139-156, TRN288-309 en TRN381-410. Door plaatsgerichte mutagenese eerst in peptidesequenties en vervolgens in full-length TRN-SR2, heb ik de volgende reeksen aminozuren in TRN-SR2 belangrijk voor de interactie met IN geïdentificeerd; K27A/R29A/R39A die slechts matig de binding aan IN beïnvloeden en Y61A/F62A, E145Q/E152Q/E153Q, D288Q/D290N en E301Q/E304Q/E308Q die de interactie met IN sterker beïnvloeden.
De transportine-SR2 - HIV-1 Integrase Interactie Mutant, IN R263A/K264A,Vertoont een Nucleair Import Defect</>
Een van de belangrijkste doelstellingen van het identificeren van de interactie interface tussen IN en TRN-SR2, was om deze informatie te gebruiken om de precieze rol van de IN/TRN-SR2 interactie tijdens de HIV-replicatie te bestuderen. De grootste uitdaging was om een IN mutant te vinden, die een verminderde TRN-SR2 interactie vertoonde, maar de reverse transcriptie van het virus niet beïnvloedde, om zijn effect op de nucleaire import van HIV te kunnenbestuderen. Ik heb geopteerd voor de IN R263A/K264A mutant die niet kaninterageren met TRN-SR2 en reverse transcriptie niet verstoort, waardoor de rol van de TRN-SR2/IN interactie in de nucleaire import van de PIC kan bestudeerd worden. Om het effect van een deficiënte IN/TRN-SR2 interactie op de nucleaire import van HIV te bestuderen, werden de R263A/K264A mutaties in een moleculaire kloon van HIV (pNL4-3) ingevoegd. Om de nucleaire import van dit virus te bestuderen werd de 2-long terminal repeat (2-LTR) cirkel formatie in de kern gemeten met behulp van Q-PCR. Ik heb ook een directe HIV nucleaire import test uitgevoerd met IN-eGFP gelabelde PICs, een techniek die oorspronkelijk door Albanese et al. werd ontworpen. In beide experimenten werd een 2-voudige vermindering van nucleaire import gemeten. Dit zijn de eerste resultaten die aantonen dat de directe interactie tussen HIV-integrase en TRN-SR2 HIV nucleaire import bemiddelt.
In conclusie, werd er een onverwacht verband tussenHIV entry en nucleaire import geïdentificeerd, waaruit blijkt dat zorg moet worden genomen bij het pseudotyperen van HIV. Het in kaart brengen van de gedetailleerde moleculaire interactie liet toe om mutaties te selecteren die aantonen dat de directe TRN-SR2/IN interactie de PIC nucleaire import en HIV-replicatie bemiddelen. Dit valideerde deze eiwit-eiwit interactie als een veelbelovend doelwit voor antivirale therapie.
We hebben ons gericht op de volgende doelstellingen:
(1) Inzicht krijgen in de werking van de N74D CA mutantop de TRN-SR2 afhankelijkheid,
(2) Het identificeren van de interactie interface van de IN/TRN-SR2 interactie en
(3) Het bestuderen van het effect van IN/TRN-SR2 interactie mutanten op HIV-replicatie.
Het effect van de N74D capside mutant op de TRN-SR2 afhankelijkheid</>
Omdat de N74D capside mutant, ongevoelig bleek voor TRN-SR2 knockdown, werd CA voorgesteld als de belangrijkste determinant van TRN-SR2 gemedieerde nucleaire import. Het eerste deel van mijn project bestond dus uit het bestuderen van deze N74D capside mutant en zijn rol in de nucleaire import in combinatie met TRN-SR2. Bij het bestuderen van de HIV-1N74D capside mutant in cellen gedepleteerd voor transportine-SR2, kon ik bevestigen dat het enkel onafhankelijk is van TRN-SR2, wanneer gepseudotypeerd met de vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne. Anderzijds vereist een N74D mutant virus capside die de wildtype HIV-1 envelope draagt, zij het wat minder dan wild type virus, nog steeds TRN-SR2 voor efficiënte replicatie. Door het pseudotyperen van WT en N74D mutante vectoren met enveloppen die pH-onafhankelijke virale opname bemiddelen (zoals HIV-1, mazelenvirus en amfotrope MLV enveloppen), kon ik aantonen dat HIV-1 N74D capside mutante virussen nog steeds afhankelijk zijn van TRN-SR2, terwijl het pseudotyperen met enveloppen die pH-afhankelijke endocytose bemiddelen (zoals het VSVG en Ebola virus enveloppen), het capside N74D mutant ongevoelig maken voor TRN-SR2 depletie. We hebben dus een rechtstreeks verband geïdentificeerd tussen de virale entry van HIV en zijn interactie met TRN-SR2. Onze hypothese is dat door een rol te spelen in uncoating, trafficking en/of docking, stappen die de specifieke interactie tussen IN en
TRN-SR2 voorafgaan, CA een indirect effect kan uitoefenen op het proces van nucleaire import.
Identificatie van de interface van de HIV-1 Integrase/Transportin-SR2 interactie</>
In een eerste stap in het begrijpen van de precieze rol van de IN/TRN-SR2 interactie, bestudeerde ik de interactie interface tussen HIV IN en TRN-SR2. Ik deed dit door een peptide gebaseerde benadering toe te passen, omde interactie hot spots van beide eiwitten te identificeren. Ik heb zowel IN en TRN-SR2 tot peptiden versneden en deze peptiden gebruikt om de cruciale aminozuren verantwoordelijk voor de interactie te identificeren. Ik identificeerde een reeks aminozuren in de CCD IN170-191 en twee reeksen aminozuren IN214-229 en IN259-274 in het CTD van IN. Door plaatsgerichte mutagenese, eerst in peptidesequenties en vandaar in full-length IN, identificeerde ik aminozuren die essentieel zijn voor de interactie. F185/K186/R187/K188 bepalen de interactie in de CCD terwijl R262/R263/K264 en K266/R269 hot spots zijn in de CTD van IN. Door het ontledenvan TRN-SR2 in korte structurele fragmenten werden vijf peptiden geïdentificeerd die de mogelijkheid tot interactie met IN behouden; TRN24-40, TRN56-74, TRN139-156, TRN288-309 en TRN381-410. Door plaatsgerichte mutagenese eerst in peptidesequenties en vervolgens in full-length TRN-SR2, heb ik de volgende reeksen aminozuren in TRN-SR2 belangrijk voor de interactie met IN geïdentificeerd; K27A/R29A/R39A die slechts matig de binding aan IN beïnvloeden en Y61A/F62A, E145Q/E152Q/E153Q, D288Q/D290N en E301Q/E304Q/E308Q die de interactie met IN sterker beïnvloeden.
De transportine-SR2 - HIV-1 Integrase Interactie Mutant, IN R263A/K264A,Vertoont een Nucleair Import Defect</>
Een van de belangrijkste doelstellingen van het identificeren van de interactie interface tussen IN en TRN-SR2, was om deze informatie te gebruiken om de precieze rol van de IN/TRN-SR2 interactie tijdens de HIV-replicatie te bestuderen. De grootste uitdaging was om een IN mutant te vinden, die een verminderde TRN-SR2 interactie vertoonde, maar de reverse transcriptie van het virus niet beïnvloedde, om zijn effect op de nucleaire import van HIV te kunnenbestuderen. Ik heb geopteerd voor de IN R263A/K264A mutant die niet kaninterageren met TRN-SR2 en reverse transcriptie niet verstoort, waardoor de rol van de TRN-SR2/IN interactie in de nucleaire import van de PIC kan bestudeerd worden. Om het effect van een deficiënte IN/TRN-SR2 interactie op de nucleaire import van HIV te bestuderen, werden de R263A/K264A mutaties in een moleculaire kloon van HIV (pNL4-3) ingevoegd. Om de nucleaire import van dit virus te bestuderen werd de 2-long terminal repeat (2-LTR) cirkel formatie in de kern gemeten met behulp van Q-PCR. Ik heb ook een directe HIV nucleaire import test uitgevoerd met IN-eGFP gelabelde PICs, een techniek die oorspronkelijk door Albanese et al. werd ontworpen. In beide experimenten werd een 2-voudige vermindering van nucleaire import gemeten. Dit zijn de eerste resultaten die aantonen dat de directe interactie tussen HIV-integrase en TRN-SR2 HIV nucleaire import bemiddelt.
In conclusie, werd er een onverwacht verband tussenHIV entry en nucleaire import geïdentificeerd, waaruit blijkt dat zorg moet worden genomen bij het pseudotyperen van HIV. Het in kaart brengen van de gedetailleerde moleculaire interactie liet toe om mutaties te selecteren die aantonen dat de directe TRN-SR2/IN interactie de PIC nucleaire import en HIV-replicatie bemiddelen. Dit valideerde deze eiwit-eiwit interactie als een veelbelovend doelwit voor antivirale therapie.
Datum:1 okt 2009 → 29 jan 2014
Trefwoorden:HIV, Nuclear import
Disciplines:Engineering van biomaterialen, Biologische systeemtechnologie, Biomateriaal engineering, Biomechanische ingenieurswetenschappen, Andere (bio)medische ingenieurswetenschappen, Milieu ingenieurswetenschappen en biotechnologie, Industriële biotechnologie, Andere biotechnologie, bio-en biosysteem ingenieurswetenschappen, Microbiologie, Systeembiologie, Laboratoriumgeneeskunde
Project type:PhD project