< Terug naar vorige pagina

Project

Moleculaire beeldvorming van neurodegeneratie en neurogenese in diermodellen.

Wereldwijd worden ongeveer een miljard mensen getroffen door een neurologische aandoening. De ontwikkeling van nieuwe technologieën is onmisbaar om onze kennis over de moleculaire processen die plaatsvinden in de hersenen, onder zowel gezonde als pathologische omstandigheden, verder uitte breiden. Bioluminescentie beeldvorming (BLI) is een eenvoudige, vrijgoedkope en gevoelige beeldvormingstechniek waarmee men een bepaald moleculair proces op een niet-invasieve manier binnen eenzelfde groep dieren kan opvolgen in de tijd. De voornaamste doelstelling van deze thesis was de ontwikkeling en karakterisering van nieuwe technologieën die ons uiteindelijk zouden toelaten verschillende neurologische processen op te volgen met BLI in levende dieren. 

De aggregatie van het eiwit alfa-synucleïne (aSYN) speelt een centrale rol in het ontstaan van deziekte van Parkinson en andere synucleïne pathologieën. De oligomerisatie van aSYN monomeren is de eerste stap in de uiteindelijke vorming van fibrillen en intracytoplasmatische inclusies die teruggevonden worden inde hersenen van patiënten. De oligomeren worden aanzien als de toxischevorm van aSYN, maar tot op vandaag is er geen manier om deze oligomerente visualiseren in celcultuur en in proefdierhersenen. Daarom hebben wij een bioluminescente complementatie techniek ontwikkeld, waarbij het luciferase afkomstig van de vuurvlieg (Fluc) gesplitst wordt in een N-terminaal en C-terminaal deel, die beide aan aSYN werden gefuseerd. In celcultuur resulteerde aSYN oligomerisatie in succesvolle complementatie en dus in de productie van zichtbaar licht. Daarenboven hadden de Fluc delengeen aantoonbare invloed op de aggregatie eigenschappen van aSYN. Vervolgens kon aSYN oligomerisatie gedurende 8 maand niet-invasief opgevolgd worden in muizenhersenen, zowel in het striatum als in de substantia nigra. De gevisualiseerde aSYN oligomeren vertoonden bovendien pathologische eigenschappen in vivo. Ten slotte testten we FK506, waarvan reeds aangetoond is dat het fibril-vorming van aSYN kan inhiberen, met deze nieuwetechniek. FK506 verhinderde aSYN oligomerisatie, zowel in celcultuur als in proefdierhersenen. Onze bioluminescente complementatie techniek zalons toelaten om onze kennis over aSYN oligomeren verder uit te breiden en zal ons helpen in de zoektocht naar nieuwe potentiële behandelingen voor de verschillende synucleïne pathologieën, zowel in celcultuur als inproefdierhersenen. 

Gedurende de hele levensduur worden nieuwe neuronen aangemaakt in twee neurogene regios, de subventriculaire zone (SVZ) en de dentate gyrus (DG). Stimulatie van deze adulte neurogenese wordt aanzien als een mogelijke manier om verschillende neurologischeaandoeningen te behandelen. We toonden reeds eerder aan dat de migratievan precursorcellen niet-invasief kan opgevolgd worden met BLI, na stereotactische injectie in de SVZ van lentivirale (LV) vectoren die Fluc tot expressie brengen. Deze LV vectoren transduceren echter niet alleen deneuronale stamcellen (NSCs), maar ook nabijgelegen astrocyten en neuronen. Dit leidt tot een hoog BLI signaal afkomstig van de SVZ, wat uiteindelijk de kwantificatie van de migratie van de precursorcellen bemoeilijkt. In een tweede deel van deze thesis hebben we daarom nieuwe conditionele Cre-Flex LV vectoren ontwikkeld. Injectie van deze vectoren in de SVZvan transgene Nestin-Cre muizen leidde tot de specifieke overexpressie van Fluc en eGFP in de NSCs. Het is reeds gekend dat beroertes adulte neurogenese beïnvloeden, o.a. door migratie van bepaalde cellen naar de beschadigde regio. Het is echter nog niet duidelijk waar deze cellen vandaan komen en wat hun differentiatie-capaciteit is. Daarom hebben we de Cre-Flex LV vectoren gebruikt om de invloed van een beroerte op de NSCs inde SVZ op te volgen met BLI. De inductie van een beroerte leidde tot een tijdelijke verhoging van zowel het BLI signaal als het aantal eGFP positieve cellen. Daarenboven werd een duidelijke migratie van de precursorcellen naar het letsel geregistreerd m.b.v. BLI. Histologische analyses toonden aan dat deze precursorcellen zowel in astrocyten als in neuronengedifferentieerd waren t.h.v. het letsel. Deze techniek laat ons dus toe om de invloed van een beroerte op de NSCs op een niet-invasieve manierop te volgen, wat uiteindelijk mogelijkheden zal bieden voor het evalueren van mogelijk nieuwe therapieën. 

In de laatste 20 jaar is een enorme vooruitgang geboekt in onze kennis over adulte neurogenese in de andere neurogene regio, de DG. Er heerst momenteel echter een grote controverse wat betreft de identiteit van de NSCs en de manier waarop deze NSCs nieuwe neuronen vormen in de DG. Daarom hebben wij in het laatste deel van deze thesis de Cre-Flex LV vectoren aangewend om neurogenese in de DG te bestuderen, zowel met BLI als met histologie. Stereotactische injectie van de Cre-Flex LV vectoren in de DG van Nestin-Cre muizen leidde tot het specifiek merken van de nestin positieve NSCs. De gemerkte populatie kon gedurende 9 maand gedetecteerd worden met BLI. Door technische beperkingen kon de continue toename in het aantal gemerkte cellenechter niet geregistreerd worden met BLI. Desalniettemin hebben we gebruik gemaakt van de specifiek gemerkte nestin positieve NSCs om hun neurogene eigenschappen m.b.v. histologische technieken te analyseren. Hieruit bleek dat een stabiele populatie van nestin positieve NSCs gedurende 9maand continu nieuwe neuronen had gevormd. Het histologische aspect vandeze technologie zal uiteindelijk toelaten om de identiteit en het werkingsmechanisme van de NSCs in de DG verder te ontrafelen.

Datum:1 okt 2009  →  24 jun 2014
Trefwoorden:Molecular imaging
Disciplines:Neurowetenschappen, Biologische en fysiologische psychologie, Cognitieve wetenschappen en intelligente systemen, Ontwikkelingspsychologie en veroudering
Project type:PhD project