Moleculaire analysis van de interactie tussen het probioticum Lactobacillus rhamnosus GG en intestinale epitheelcellen.

Probiotica worden gedefinieerd als “levende micro-organismen die, indien toegediend in voldoende hoeveelheden, een positief gezondheidseffect kunnen hebben op de gastheer. Er zijn steeds meer klinische en experimentele studies die tonen dat bepaalde bacteriële stammen of combinaties vanstammen, vaak lactobacillen en bifidobacteriën, positieve effecten kunnen hebben op de gezondheid. De interacties tussen probiotische bacteriënen de gastheer worden voornamelijk uitgevoerd door specifieke moleculaire structuren of microbe-geassocieerde moleculaire patronen (MAMPs), dieherkend kunnen worden door patroonherkenningsreceptoren (PRRs) van de gastheer, zoals Toll-like receptoren (TLRs). Jammer genoeg wordt in klinische studies te weinig aandacht besteed aan de moleculaire werkingsmechanismen. Nochtans geloven wij dat voor een optimale toediening van probiotica, het noodzakelijk is om de mechanismen van de interactie met de gastheer in detail te begrijpen. In dit werk gebruiken we het modelprobioticum Lactobacillus rhamnosus GG. Deze bacterie is één vande best beschreven probiotische stammen. Bewezen effecten zijn onder andere het bevorderen van gastro-intestinale gezondheid, voorkomen van luchtweginfecties en modulatie van het immuunsysteem. 
In dit doctoraatsonderzoek hebben we een platform ontwikkeld om de PRR-gestuurdeprobiotische mechanismen beter te begrijpen, specifiek in de interactiemet intestinale epitheelcellen (IECs). We kozen om vooraf beschreven componenten van de celwand van L. rhamnosus GG verder te onderzoeken: lipoteichoïnezuur (LTA), de SpaCBA pili en de belangrijkste gesecreteerde proteïnen Msp1 en Msp2. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat de promiscuereceptor TLR-2 een belangrijke PRR voor L. rhamnosus GG zou kunnen zijn. Eerst ontwikkelden we TLR reportercellijnen in HEK293T modelcellen om te analyseren of bacteriële celwandcomponenten NF-κB signalisatie konden activeren via specifieke TLRs. Een belangrijke innovatieve ontwikkeling van dit doctoraat was de ontwikkeling van een stabiele TLR-2/TLR-6reporter cellijn. Hierbij wilden we de rol van bacteriële celwandcomponenten als MAMPs onderzoeken door ze in verschillende vormen te incuberenmet de reportercellijn: opgezuiverde fracties (al dan niet met chemische modificatie), recombinante proteïnen en mutante stammen die toelaten de MAMPs te onderzoeken in hun cellulaire omgeving. Een volgende stap wasde opheldering van structuur-activiteitsrelaties (SAR). Ten slotte wilden we de resultaten bevestigen in een meer complexe opbouw in IEC lijnen. 

LTA wordt beschouwd als de Gram-positieve tegenhanger vande Gram-negatieve lipopolysacchariden. In dit doctoraat konden we aantonen dat LTA een belangrijke MAMP is van L. rhamnosus GG voor de interactie met TLR-2, alleen wanneer het in een heterodimeer is met TLR-6, door gebruik te maken van opgezuiverd LTA en een mutante stam met LTA met een aangepaste structuur. De SAR analyse bevestigde dat de acylketens van het glycolipideanker cruciaal zijn voor binding aan de receptor. Deze resultaten werdenbevestigd in de IEC lijn Caco-2, aangezien LTA expressie van het pro-inflammatoire chemokine interleukin-8 induceerde. Deze resultaten ondersteunen een sleutelrol voor LTA bij de stimulatie van het immuunsysteem door L. rhamnosus GG. 

SpaCBA pili zijn proteïnemultimeren die lange, dunne structuren vormen op hetceloppervlak en cruciaal zijn voor de goede adhesiecapaciteit van L. rhamnosus GG. We maakten gebruik van isogene enkele en dubbele mutanten van de bacterie in coincubatie met de TLR-2/TLR-6 reportercellijn. De data suggereren dat de SpaCBA pili de TLR-2/TLR-6 interactie van andere liganden, zoals LTA, verhinderen. Om een beter inzicht te verwerven in de immunomodulatorische rol van de pili, werd een protocol geoptimaliseerd voor de opzuivering van natieve pili.  Het is verrassend dat de eerste resultaten met de opgezuiverde pili aangeven dat ze significant NF-κB signalisatie kunnen activeren in de TLR-2/TLR-6 reportercellijn bij een concentratie van 5 µg/ml.
Eerder onderzoek toonde aan dat de gesecreteerde proteïnen Msp1 en Msp2 de homeostase in IECs bevorderen, afhankelijk van Akt signalisatie. Hier tonen we dat 10-100 µg/ml van de recombinante proteïnen TLR-2/TLR-6 gemedieerde NF-κB signalisatie kon activeren. Ook het opgezuiverde geglycosyleerdeMsp1 toonde deze activiteit,  wat aanduidt dat de glycosylatie geen belangrijke rol speelt in deze interactie. De rol Msp1/2 geactiveerde TLR-2/TLR-6 signalisatie in de Akt activatie wordt nog onderzocht. 

Dit doctoraat heeft bijgedragen tot een beter moleculair inzichtin de MAMP- TLR-2/TLR-6 interacties van L. rhamnosus GG. We zijn overtuigd dat de unieke aanpak met het gebruik van zowel proteïnen (recombinant en natief) en mutante stammen kan helpen in het begrijpen van MAMP-PRR interacties en SAR. Dit platform kan verder de probiotische werkingsmechanismen helpen begrijpen en kan helpen in het ontwerpenvan nieuwe toepassingen, niet alleen voor L. rhamnosus GG, maar ook voor andere stammen.