Lokale en systemische immuun interacties bij kwaadaardige gliomen.

Glioblastoma (GBM), de meest frequent voorkomende primaire intrinisieke hersentumor, is zonder twijfel één van meest dodelijke ziekten gekend bij de mens. GBM wordt behandeld met een neurochirurgische resectie, gevolgd door radio- en chemotherapie. Echter, de prognose van deze patiënten is ondanks deze behandeling infaust. Mediane overleving is slechts 15 maanden en minder dan 20% van de patiënte overleeft meer dan 3 jaar. Reeds bij diagnose zijn er GBM cellen die infiltreren voorbij de zichtbare tumor grens, welke een volledige chirurgische resectie onmogelijk maken. Een therapie-resistente subpopulatie van deze achtergebleven cellen zal uiteindelijk leiden tot ziekte herval.

In de voorbije 20 jaar heeft immunotherapie interesse opgewekt als mogelijke vierde behandelingsstrategie. Immunotherapie is theoretisch aantrekkelijk. Ten eerste kunnen tumor-infiltrerende cytotoxische immuuncellen alle invasieve tumorcellen bereiken zonder het normale omliggende hersenweefsel te beschadigen. Ten tweede is er de mogelijkheid tot het opbouwen van immunologisch geheugen, welke kan leiden tot langdurige resultaten, zonder de noodzaak tot blijvende therapie toediening. Deze concepten werden voor GBM reeds aangetoond in preklinische dierenmodellen met verschillende vaccinatiestrategieën. Er bestaan tot op heden echter geen gerandomizeerde immunotherapie studies die een overlevingsvoordeel kunnen aantonen.

Dit onderzoeksproject had als doel meer inzicht te krijgen in de complexe interacties tussen het immuunsysteem en GBM, in het bijzonder in de verschillen tussen immuunprofielen in de lokale tumor micro-omgeving en het systemisch / perifeer compartiment. Onze hypothese is dat een beter begrip over hoe het immuun systeem interageert met een ontwikkelend GBM essentieel is om effectieve immunotherapie te ontwikkelen, of ten minste te begrijpen waarom succesvolle preklinische behandelingen niet werken in de klinische praktijk. Voor dit onderzoek gebruikten we zowel tumor weefsel als bloedstalen van glioma patiënten, alsook het orthotope GL261 maligne glioma model in de muis waarin maligne hersentumoren geïnduceerd worden door stereotactische injectie van GL261 cellen.

In het eerste deel van het onderzoek (Hoofdstuk 3 – Research paper 1) bestudeerden we immuun checkpoint molecule PD-1 als huidig paradigma voor studies met immuuntherapie in verschillende kankers. PD-1 is een proteïne dat tot expressie komt op het celmembraan van geactiveerde T-lymfocyten en, na binding met zijn ligand PD-L1, aanleiding geeft tot een negatief feedback signaal in de cel. Deze pathway wordt door verscheidene kankers gebruikt om infiltrerende lymfocyten te onderdrukken. Blokkade van PD-1 met monoclonale antilichamen leidde tot reactivatie van tumor-reactieve T cellen en verlengde overleving in gevorderde melanomas en andere kankers. Met flow cytometrie toonden we een sterke opregulatie van PD-1 op tumor-infiltrerende CD4+, CD8+ en regulatoire T cellen. Deze opregulatie was niet beperkt tot GBM, maar ook aanwezig in graad 2 en 3 gliomen. Bovendien toonden we aan dat PD-1 expressie op circulerende T-lymfocyten niet verschilt tussen patiënten en gezonde vrijwilligers. In het GL261 model vonden we een vergelijkbare opregulatie van PD-1 op hersen-infiltrerende T cellen, en opvallend verlengde overleving met een CD8+ gedreven T cell reactie na behandeling met een PD-1 blokkerend antilichaam. Dit onderzoek ondersteunt verdere studies waarin PD-1 blokkade strategieën worden gebruikt.

In het tweede deel van het onderzoek (Hoofdstuk 4 – Research paper 2) gingen we na of lokale en systemische immuunprofielen in humaan GBM konden gerelateerd zijn aan specifieke biologische subgroepen van GBM. We bestuurden hiervoor een grote groep patiënten met histologisch bevestigd GBM, die werden behandeld met standaard therapie en experimentele immuuntherapie. Tumoren werden op basis van DNA methylatie patronen onderverdeeld in 4 subgroepen en 1 restgroep met niet-classificeerbare tumoren. Met immuunhistochemie konden we tumor-infiltrerende CD3+ T cellen tellen en we vonden dat deze significant meer voorkwamen in tumoren van de mesenchymale subgroep. Anderzijds, IDH tumoren hadden de laagste CD3+ T cel infiltratie. Deze T cel infiltratie contrasteerde met de algemene overleving, welke significant langer was bij IDH tumoren dan mesenchymale tumoren. In multivariate analyse bleef DNA methylatie gebaseerde stratificatie van GBM een onafhankelijke variabele voor overleving. We karakteriseerden ook CD68+ myeloide infiltraties, maar dit bleek geen relatie te vertonen met methylatie subgroepen of overleving. Met flow cytometry werden de T cell populaties van deze patiënten in het bloed voor en na radiochemotherapie onderzocht. We vonden een algemene daling van lymfocyten na radiochemotherapie, maar relatieve toename van CD8+ and CD8+PD-1+ T cellen in alle subgroepen behalve IDH tumoren. Deze resultaten ondersteunen de hypothese dat histologisch identieke GBM kunnen worden onderverdeeld in relevante biologische subgroepen, welke verband hebben met overleving en T cel infiltratie. Subclassificatie lijkt ook zinvol voor studies aangezien het aannemelijk is dat de werkzaamheid van nieuwe therapieën beperkt kan zijn tot één of enkele subgroepen.

In het laatste deel van het onderzoek (Hoofdstuk 5 – Research paper 3) onderzochten we het effect van subcutane implantaties van levende syngeneïsche GL261 cellen in het GL261 maligne glioma muis model. We beschouwen levende tumor cel vaccinatie theoretisch als het meest basale type vaccinatie, wat toelaat inzicht te krijgen in verschillen in immuniteit bij verschillende tumor locaties en tijdstippen van vaccinatie. De interesse in heterotope levende tumor cel implantaties komt voort uit de zeldzaamheid van extracraniële metastasen bij GBM, ondanks de lokale aggressiviteit en frequente systemische verspreiding van individuele tumor cellen. We observeerden dat subcutaan geïmplanteerde GL261 cellen worden afgestoten in > 80% van de muizen, terwijl cerebrale implantaties lethale tumoren induceren bij alle muizen. Verder zagen we dat 79% van de muizen die subcutane tumoren hadden afgestoten, beschermd waren tegen een intracraniële tumor implantatie nadien (profylactisch model). Immunologisch zagen we in de hersenen van deze gevaccineerde muizen een vroege CD3+ CD8+ T cel influx en vermindering van de regulatoire T cellen. Als opvallende bevinding bleek er een initiëel hoge PD-1 expressie in gevaccineerde muizen, die vervolgens afnam tot de basale PD-1 expressie 4 weken na intracerebrale tumor implantatie. Deze evolutie werd niet gezien bij controle muizen. Ondanks de hoge bescherming in het profylactisch vaccinatie model was er geen verlengde overleving na subcutane GL261 implantatie in muizen met reeds aanwezige cerebrale tumoren. Bovendien zagen we nooit subcutane tumorgroei indien levende tumorcellen subcutaan werden ingespoten na intracerebrale implantatie. Deze bevindingen bevestigen dat de capaciteit van het immuunsysteem om tumor cellen te controleren en overwinnen afhankelijk is van de implantatieplaats, and locatie-gebaseerde profylactische vaccinatie mogelijk is met levende tumor cellen. Indien er echter reeds een hersentumor aanwezig is, kunnen perifeer ingebrachte levende tumorcellen geen klinisch nuttige immuniteit maar ook geen subcutane tumoren meer opwekken. Gezien er verschillende immunologische antwoorden ontstaan na subcutane GL261 implantatie in het profylactisch model vergeleken met het model met reeds aanwezige intracerebrale tumor, is verder onderzoek naar de subcutane micro-omgeving met pathologie and immunohistochemie na GL261 implantatie in de verschillende modellen momenteel lopende.