< Terug naar vorige pagina

Project

Kwantitatieve Metagenoomanalysen: aanwenden van bacteriestammen als interne standaarden voor de analyse van fecale microbiomen.

De technologische vooruitgang in DNA-sequentiebepaling heeft geleid tot de ontwikkeling van innovatieve onderzoeksstrategieën gericht op de studie van microbiële ecosystemen. Één van deze strategieën betreft metagenoomanalyse: de studie van een microbiële gemeenschap door de sequentiebepaling van willekeurig uit een klinisch of omgevingsstaal gegenereerde DNA-fragmenten (het metagenoom). Metagenoomanalyses geven de mogelijkheid om de grote verscheidenheid aan (vaak slechts in beperkte mate cultiveerbare) microbiële gemeenschappen die geassocieerd zijn met het menselijk lichaam in detail te bestuderen. Gebruik makend van deze techniek hebben recente studies een reeks associaties blootgelegd tussen de samenstelling van de bacteriële colongemeenschap en een brede waaier aan pathologieën, waaronder darmontstekingen, kanker, obesitas en diabetes. Waar voorheen de focus lag op het identificeren van een enkel(e) gen(en), metaboliet of bacteriestam als oorzaak van een bepaalde aandoening, wordt er nu meer aandacht geschonken aan de globale microbiële dynamiek in het darmstelsel. De nadruk ligt hierbij op het analyseren van een eventuele verstoring (dysbiose) van de normale bacteriële soortendiversiteit en de effecten van complexe wijzigingen in functionele/metabolische gemeenschapsdynamiek op de menselijke gezondheid.

Ondanks het enorme intrinsieke potentieel van metagenoomanalyses kampt de techniek momenteel nog steeds met enkele kinderziekten die een eventuele vertaling van bevindingen naar de klinische praktijk bemoeilijken. Een van deze kinderziekten betreft het verwerven van een werkelijk kwantitatief inzicht in het menselijk darmecosysteem. Tot op heden kan vergelijkend metagenoomonderzoek enkel inzichten verschaffen inzake de relatieve abundantie van de verschillende microbiële taxa die samen de menselijke (colon)microbiota vormen. Hierbij wordt de abundantie van microbiële soorten of van metabolische routes in een metagenoom berekend als een fractie van de totale collectie gesequeneerde DNA-fragmenten. Met de huidige metagenoomanalysetechnieken is het dus onmogelijk een shift in relatieve abundantie van bacteriële fyla in absolute termen te duiden als bloei van het ene, dan wel reductie van het andere fylum, of een combinatie van beide. Er is dan ook nood aan de ontwikkeling van een kwantitatieve metagenoomanalysemethodologie om de variaties in de microbiële gemeenschapscompositie in kaart te brengen. Enkel zo kan de variatie tussen personen en in de tijd verklaard worden met betrekking tot gezondheidsstatus of medische behandeling. De kwalitatieve/relatieve aard van de huidige metagenoomanalyses verhindert de verdere ontwikkeling van een accuraat inzicht in het menselijk microbieel ecosysteem en de vertaling van metagenoomresultaten naar medische diagnostiek en behandelingen.

 

Het menselijke gastro-intestinaal kanaal herbergt één van de meest dense bacteriële gemeenschappen tot op heden toe beschreven. De bacteriële densiteit van fecale stalen schommelt rond de 1011 bacteriën per gram. Echter, deze densiteit kan variëren tussen 1010 en meer dan 5.1011 bacteriën per gram, afhankelijk van het individu en van het tijdstip van staalname. Dit betekent dat de concentratie bacteriën in fecale stalen met meer dan een factor honderd kan variëren. De gevolgen van mogelijke variaties in de totale bacteriële abundantie worden in het huidige metagenoomonderzoek grotendeels genegeerd. Nochtans zullen deze onmiskenbaar een effect hebben op interacties tussen microbiota en gastheer, met mogelijke invloed op de menselijke gezondheid.

 

Technologische ontwikkelingen van de laatste jaren laten toe meer dan 100 gigabasen DNA per dag te sequeneren en maken het mogelijk om de microbiële diversiteit van duizenden individuen in kaart te brengen. Ondanks de duidelijke vooruitgang in metagenoomanalysetechnieken, blijven enkele fundamentele problemen tot op heden onopgelost, voornamelijk wat technische optimalisatie en de interpretatie in een ecosysteemcontext betreft. Het in kaart brengen van een metagenoom gebeurt door een opeenvolging van technische stappen die elk een specifieke bias introduceren en zo kwantitatieve of absolute metagenoomanalyse bemoeilijken. Zo veronderstelt DNA-extractie vertrekkende van een ecosysteem dat alle aanwezige bacteriën in dezelfde mate aan cellyse onderhevig zijn, wat helaas niet het geval is. De daaropvolgende aanhechting van sequencing primers vergt de verdunning van DNA naar optimale PCR concentraties. Tenslotte gebeurt het eigenlijke sequencen steeds in batch, waarbij diverse stalen gepoold worden in equimolaire concentraties. Op deze wijze gaat bij de staalvoorbereiding in de workflow van een metagenoomanalyse de oorspronkelijke abundantie van de onderzochte taxa echter verloren.

 

Het huidige metagenoomonderzoeksveld gaat ervan uit dat relatieve abundanties voldoende signaal bevatten voor de ontwikkeling van diagnostische kits en identificatie van targets. Dit is echter niet bewezen. In een recente studie van >1000 fecale stalen toonden we aan dat slechts 8% van de microbioomvariatie kan geassocieerd worden met gastheereigenschappen. De werkhypothese van dit project is dan ook dat relatieve kwantificatie essentiele variabiliteit en relevante signalen mist omdat er geen rekening gehouden wordt met de absolute aantallen van organismen. Het doel van dit project is om een werkelijk kwantitatieve methode voor metagenoomanalyse te ontwikkelen met behulp van geselecteerde bacteriestammen als interne standaarden (IS).

 

Concreet zal er een innovatieve upstream methode voor metagenoomanalyse ontwikkeld worden, vetrekkende van fecale stalen. Door de toevoeging van bacteriële IS als eerste stap van de staalvoorbereiding zal het mogelijk worden om uit de metagenomische dataset af te leiden wat de absolute abundantie, in tegenstelling tot relatieve abundantie, van bacteriële taxa in de onderzochte stalen is. De mogelijkheid om een werkelijke kwantitatieve metagenoomanalyse uit te voeren op de bacteriële gemeenschap in het menselijke darmecosysteem, zal een significante sprong voorwaarts betekenen voor de ontwikkeling van metagenoomanalyses als tool in de medische diagnostiek. Dit onderzoeksproject zal uitgevoerd worden aan het Raes Lab binnen het Laboratorium voor Moleculaire Bacteriologie (KU Leuven). De onderzoeksgroep focust haar activiteiten op de karakterisering van microbiële gemeenschappen op systeemniveau via de analyse van high-throughput -omics data (metagenomics, metatranscriptomics, metaproteomics en meta-metabolomics). 

Datum:18 aug 2014 →  30 jun 2018
Trefwoorden:fecale microbiomen, Kwantitatieve, bacteriestammen, Metagenoomanalysen
Disciplines:Ecologie, Milieuwetenschappen en management, Andere milieuwetenschappen, Microbiologie, Systeembiologie, Laboratoriumgeneeskunde, Engineering van biomaterialen, Biologische systeemtechnologie, Biomateriaal engineering, Biomechanische ingenieurswetenschappen, Andere (bio)medische ingenieurswetenschappen, Milieu ingenieurswetenschappen en biotechnologie, Industriële biotechnologie, Andere biotechnologie, bio-en biosysteem ingenieurswetenschappen
Project type:PhD project