< Terug naar vorige pagina

Project

Karakterisatie en engineering van een polysacharide mono-oxygenase betrokken in de afbraak van (ligno)cellulose biomassa (178BW0913)

Van lignocellulose biomassa wordt algemeen gedacht dat het de meest belovende hernieuwbare grondstof is voor duurzame productie van biobrandstoffen en alledaagse chemicaliën in zogenaamde bioraffinaderijen. Terwijl de nood voor zulke hernieuwbare systemen voortdurend toeneemt, blijkt het gebruik van lignocellulose biomassa erg moeilijk door zijn weerstand tegen depolymerisatie. Hierdoor verloopt de ontwikkeling van een kostenefficiënt proces erg moeizaam. In de klassieke modellen voor enzymatische afbraak van cellulose, werken verschillende endo- en exocellulasen samen voor hydrolytische splitsing van de -1,4-binding tussen de glucose moleculen. Recent werd dit beeld volledig herzien door de ontdekking van de lytische polysaccharide monooxygenasen (LPMO’). Deze metalloproteïnen oxideren de glycosidische binding, waardoor de kristalliene structuur verbroken wordt en dus meer toegankelijk voor de klassieke cellulasen. Op die manier maken ze het depolymerizatieproces efficiënter. Er bestaat weinig twijfel over het enorme potentieel in kostenvermindidering dat deze enzymen teweeg kunnen brengen. Hierdoor krijgen de LPMO’ zeer veel aandacht en groeit de kennis over deze interessante klasse van enzymen erg snel. Vele eigenschappen en aspecten zijn totnogtoe niet bekend. Eén van deze eigenschappen is de enzym stabiliteit. Nochtans is dit een industrieel zeer interessante parameter omdat processen op hogere temperatuur een verlaagd kans op contaminatie en een verhoogde reactiesnelheid tot gevolg hebben. Daarom werd in deze doctoraatsthesis een studie gemaakt van de stabiliteit van 2 LPMO’ en werden er verschillende enzyme engineering strategieën uitgetest om de stabiliteit te verhogen. Slechts 2 LPMO klassen zijn actief op (hemi)cellulose substraat, waardoor ze interessant zijn voor gebruik in bioraffinaderijen. Daarom werd het onderzoek enkel op deze klassen toegespitst. Het gaat over de auxiliary activity families 9 (AA9) en 10 (AA10). Van elke klasse werd 1 enzym bestudeerd. Voor familie AA9, werd een LPMO van Trichoderma reesei uitgekozen, namelijk TrCel61A. Deze natuurlijke schimmel is ervoor bekend een efficiënt cellulase systeem te produceren. Voor familie AA10, werd het eerste bacteriële LPMO uitgepikt dat actief bevonden werd op cellulose substraat. Het gaat over ScLPMO10C (vroeger ScCelS2) uit de bodembacterie Streptomyces coelicolor. Het eerste enzym, TrCel61A, werd heteroloog tot expressie gebracht in de eukaryote gist Pichia pastoris om post-translationele modificaties mogelijk te maken. Een bijzondere eigenschap van LPMOs, waarmee men rekening moet houden tijdens productie, is dat een N-terminaal histidine residue (His-1) noodzakelijk is voor de activiteit. Om dit te bekomen werd het eiwit extracellulair tot expressie gebracht en werden er verschillende secretiesignalen vergeleken. Hieruit bleek dat het natieve secretiesignaal van TrCel61A veel beter presteerde dan onder andere het algemeen gebruikte -secretiesignaal uit S. cereviae. De hoogste LPMO opbrengst in P. pastoris kon bekomen worden ( > 400 mg/ L tijdens een fermentatie), waarbij tevens ook een correct N-terminus (His-1) gegarandeerd werd. Vervolgens werden de activiteit en stabiliteit gemeten van TrCel61A. Phosphoric acid swollen cellulose (PASC) werd hierbij als substraat gebruikt en de resulterende reactieproducten werden geanalyseerd via high performance anion-exchange chromatography (HPAEC, een gespecialiseerde soort HPLC). Voor het eerst kon LPMO activiteit voor TrCel- 61A beschreven worden en bovendien kon aangetoond worden dat het om een type-3 LPMO gaat, omwille van de generatie van neutrale zowel als C1- en C4-geoxideerde producten. Daarnaast werd de stabiliteit gemeten via differential scanning fluorimetry (DSF), waarbij een thermische denaturatie curve bekomen wordt. Als parameter wordt hierbij de schijnbare smelttemperatuur (Tm) vergeleken tussen enzymen. Deze parameter komt overeen met het buigpunt van de smeltcurve. De meetmethode werd als gevoelig en herhaalbaar beschouwd met een lage technische en biologische variabiliteit. Daarnaast werd voor TrCel61A, een schijnbare smelttemperatuur van 62 1 °C opgemeten. Ten slotte werden een aantal enzyme engineering strategieën toegepast op TrCel61A. Allereerst werd hierbij enkel het eigenlijke katalytische deel tot expressie gebracht. Aangezien dit geen verbetering in stabiliteit opbracht, werd het volledige enzym (met linker regio en koolhydraat bindende module) als startpunt voor de engineering genomen. Ten tweede bleek introductie van extra N-gycosylatie posities en disulfidebruggen geen verbetering in stabiliteit teweeg te brengen. Als laatste werd het principe van consensus engineering toegepast nadat een fylogenetsiche boom was opgesteld. Hoewel deze enzym varianten goed tot expressie kwamen, brachten ze een significante daling in thermodynamische stabiliteit met zich mee. Het tweede enzym, ScLPMO10C, werd geproduceerd in de prokaryote gastheer Escherichia coli. Rekening houdend met de His-1 voorwaarde, werd het enzym naar de periplasmatische ruimte geleid door gebruik te maken van een secretiesignaal. ScLPMO10C vertoonde ook activiteit op PASC als type-1 LPMO, waarbij neutrale en C1-geoxideerde producten bekomen worden. Hoewel een bescheiden schijnbare smelttemperatuur van 51 1 °C gemeten werd, bleek het enzym een verrassend hoge residuele activiteit (34 %) te vertonen nadat het 2 uur op 80 °C geïncubeerd was. Deze speciale eigenschap werd toegewezen aan de disulfide bruggen. Ten slotte werden ook een aantal engineering strategieën toegepast met het oog op verbetering van de stabiliteit. Hoewel enkele rationele veranderingen in het enzym oppervlak niet tot een verbeterde stabiliteit leidden, kon de introductie van disulfide bruggen dat wel. Bij verschillende varianten werd een verhoging in Tm gemeten, gaande van +2 tot +9 °C. Door combinatie van deze positieve disulfide bruggen kon een sterk verbeterde variant bekomen worden. Hiervoor werd een verbetering van +12 °C op vlak van Tm gemeten en deze variant vertoonde na 2 uur incubatie op 80 °C wel 60 % residuele activiteit (ten opzichte van 34 % voor het oorspronkelijk enzym). Deze verbetering is zeer belangrijk en brengt de smelttemperatuur naar een industrieel relevante temperatuur. Om af te sluiten, ookal leidden niet alle engineering strategieën tot verhoging in stabiliteit, een aantal interessante aspecten in verband met LPMO stabiliteit konden worden bloodgelegd. Daarnaast kon ook besloten worden dat disulfide bruggen essentiële elementen zijn in de stabiliteit van LPMOs.

Datum:1 jan 2013  →  31 dec 2016
Trefwoorden:(ligno) cellulose biomassa, depolymerizatie
Disciplines:Systeembiologie