Isolatie en karakterisatie van genen die de groei bij lage temperatuur beïnvloeden in Serratia plymuthica RVH1

Gekoelde voedingsmiddelen vormen een van de snelst groeiende segmenten van de voedingsindustrie. Gekoelde bewaring is nodig omdat deze voedingsmiddelen bederfbaar zijn en vatbaar voor groei van micro-organismen die ziekte of bederf kunnen veroorzaken. Psychrotrofie, dit is het vermogen om te groeien bij temperaturen beneden 4 °C, komt wijd verspreid voor in verschillende fylogenetische lijnen van bacteriën, maar varieert vaak op genus-, species- of stamniveau. De aanpassingen waardoor bacteriën kunnen groeien bij lage temperatuur zijn niet enkel interessant vanuit zuiver wetenschappelijk oogpunt, maar ook omdat ze kunnen leiden tot verbeterde strategieën om ongewenste psychrotrofen in de voedselketen te beheersen. De moleculaire en cellulaire basis van psychrotrofen is vooral bestudeerd in Gram-positieve bacteriën, Listeria monocytogenes in het bijzonder. Andere psychrotrofe voedselbacteriën zoals die behorend tot de Enterobacteriaceae familie zijn veel minder bestudeerd. Daarom had het voorliggende werk tot doel om het inzicht in de mechanismen die nodig zijn voor de groei van enterobacteriën onder koudestress te verbeteren. Serratia plymuthica RVH1, een psychrotrofe stam geïsoleerd uit een grootkeuken die uitvoerig is bestudeerd in onze onderzoeksgroep, werd gekozen voor dit onderzoek, dat was gebaseerd op een initiële strategie van genoomomvattende mutationele analyse.

Een transposonmutantenbank van S. plymuthica werd geconstrueerd en gescreend voor mutanten met verminderde groei bij lage temperatuur maar normale groei bij optimale temperatuur [30 °C]. Vier psychrotrofiemutanten met consistent verminderde groei bij 4 en 10 °C werden geïsoleerd en genetisch geanalyseerd. De transposons in deze mutanten werden gelocaliseerd in voorspelde open leesramen van plsC [1-acyl-sn-glycerol-3 fosfaat acyltransferase], mnmA [tRNA-specifiek 2-thiouridylase], een naamloos gen [polysaccharide pyruvyl transferase], en ubiB [2-octaprenylfenol hydroxylase]. Behalve plsC [vetzuursynthese] was geen van deze genen of de overeenkomstige pathways waarin ze betrokken zijn, al eerder in verband gebracht met psychrotrofie. Omdat de plsC en mnmA mutanten weinig of een sterk verminderde groei vertoonden bij 10 en 4 °C werden deze geselecteerd voor meer gedetailleerde analyse.

De mutant met een transposoninsertie in het stroomopwaartse gebied van het plsC gen dat codeert voor een lysofosfatidinezuur acyltransferase betrokken in de biosynthese van fosfatidinezuur [PA, een primair intermediair in de biosynthese van membraanglycerolipiden], vertoonde een zes- tot zevenvoudig verminderde verhouding van palmitoleïnezuur tot oliezuur [C16:1 / C18:1], maar de verhouding van verzadigde tot onverzadigde vetzuren was onveranderd. Het groeidefect bij lage temperatuur en de vetzuursamensteling werden grotendeels hersteld door introductie van een complementatieplasmide waarop plsC tot overexpressie was gebracht. Groei bij lage temperatuur werd ook deels hersteld door supplementatie van het groeimedium met C16:1, wat er op wees dat een verschuiving van C18:1 naar C16:1 nodig was voor psychrotrofie. De mutant was ook significant meer gevoelig voor behandeling met hoge druk bij 250 MPa, maar niet bij hogere drukken. De groei van de mutant was ook verminderd bij lage pH maar niet bij verhoogde NaCl concentratie. Deze resultaten verschaffen nieuwe informatie over de rol van vetzuursamenstelling in bacteriële stresstolerantie. De impact van de geobserveerde vetzuurverschuiving op koudeadaptatie is in overeenstemming met het welgekende homeovisceuze-adaptatieprincipe, maar hoe de uitschakeling of modulatie van PlsC activiteit in de mutant deze verschuiving precies veroorzaakt is nog onduidelijk. Deze mutant kan bijgevolg nuttig zijn in toekomstige studies naar de precieze rol van PlsC in S. plymuthica.

Een tweede mutant die aan meer gedetailleerde analyse werd onderworpen had een transposoninsertie in mnmA, een gen dat codeert voor een tRNA-specifiek 2-thiouridylase betrokken in de 2-thiouridine-modificatie [s2] op de wobble positie in de anticodon stam-lusstructuur. In een parallelle screening in het kader van een ander project in onze onderzoeksgroep werd een ander tRNA modificatiegen, mnmE, geïdentificeerd dat nodig was voor groei van E. coli MG1655 in mild-zure condities. Omdat deze bevindingen uit onafhankelijke screenings een algemene rol voor tRNA modificatie in stressmanagement suggereerden, werden knockouts van beide genen in beide bacteriën onderzocht op hun tolerantie ten opzichte van lage en hoge groeitemperatuur, osmotische en oxidatieve stress, zuurstress en inhibitoren van proteïnesynthese. De mnmA-afhankelijke modificatie was nodig voor normale groei bij lage temperatuur in S. plymuthica, maar bij hoge temperatuur in E. coli. De effecten van MnmA op groei onder temperatuurstress in beide bacteriën verdwenen echter wanneer ze werden opgegroeid bij een verhoogde concentratie [2 – 3 % w/v] natriumchloride in het medium. De MnmE modificatie had geen effect op de groei onder temperatuurstress in S. plymuthica of E. coli. Zowel MnmA als MnmE waren echter onmisbaar voor normale groei van E. coli in mild-zure condities, terwijl deze rol in S. plymuthica minder uitgesproken was. Verder ondersteunde MnmA de overleving bij blootsteling aan lethale ter-butylhydroperoxide concentratie. Tenslotte werd ook de gevoeligheid aan antibiotica die de nauwkeurigheid van translatie verstoren beïnvloed door MnmA- en MnmE-afhankelijke modificaties op een stamafhankelijke manier, wat hun betrokkenheid in proteïnesynthese bevestigde. Modificaties van tRNA uridine op de wobble positie in de anticodon stam-lus zijn belangrijk voor de efficiëntie en nauwkeurigheid van translatie. Gebrek aan deze modificaties veroorzaakt translatie-inefficiëntie, waarvan de fysiologische gevolgen versterkt worden onder stresscondities. Dit kan verklaard worden door eerder geformuleerde twee modellen over de rol van tRNA modificatie. Het eerste model veronderstelt dat de translatie van stressresponsproteïnen sterker afhankelijk is van gemodificeerde tRNAs dan de translatie van andere proteïnen. Dit omdat stressresponstranscripten rijk zijn aan codons die vertaald worden door gemodificeerde tRNAs. Wanneer de vraag naar dergelijke tRNA’s niet kan voldaan worden zal de translatie van de stressresponstranscripten verminderen, en bijgevolg ook het vermogen van de cel om de stress te overwinnen. Het tweede model veronderstelt een rol van tRNA modificaties in het behoud van proteoomhomeostase. De afwezigheid van tRNA modificaties in stresscondities zou pauzering van de ribosomen induceren, met de vorming van toxische proteïneaggregaten tot gevolg, en een verstoring van de integriteit van het proteoom.

Samenvattend heeft dit werk een bijdrage geleverd tot een beter begrip van sommige genen en cellulaire functies die vereist zijn voor psychrotrofie in S. plymuthica. Sommige van deze functies werden nog niet eerder in verband gebracht met psychrotrofie. Vetzuursamenstelling en tRNA modificatie werden in meer detail bestudeerd, en bleken ook een rol te spelen in de tolerantie tegenover andere stressfactoren. Kennis van de cellulaire processen en pathways betrokken in groei bij lage temperatuur kan mogelijk bijdragen tot de ontdekking van nieuwe bewaarmiddelen die specifiek werkzaam zijn tegen psychrotrofe bacteriën in gekoelde voedingsmiddelen, en op die manier de veiligheid en stabiliteit van deze voedingsmiddelen kunnen verhogen.