iPSC Technologie en Bot Regeneratie

Bot is een gecalcificeerd weefsel met meerdere functies. Het laat beweging toe door het voorzien van hechtingspunten voor skeletale spieren, ondersteunt hematopoëse, slaat mineralen op en beschermt zacht weefsel en organen. Ook heeft bot de unieke capaciteit om zich na beschadiging te herstellen zonder littekenvorming of verlies van functie.

Het herstel van botbreuken weerspiegelt de embryonale endochondrale botvorming. Dit proces is gekarakteriseerd door de vorming van een kraakbeenachtige structuur (zachte callus) dat aan botvorming voorafgaat. Deze structuur wordt beschouwd als een van de belangrijkste tussenfases tijdens endochondrale botvorming aangezien dit een structureel sjabloon vormt voor ossificatie. Bovendien rekruteert dit weefsel nabijgelegen osteogene cellen en bloedvaten.

Ondanks deze regeneratieve eigenschappen wordt bot(breuk)herstel vaak gehinderd door plaatselijke en aangeboren factoren. 10% van alle breuken geneest niet goed of resulteert in niet aaneengesloten herstel. Botweefsel engineering probeert een oplossing te bieden door stamcelbiologie te combineren met ingenieurswetenschappen. Skeletale stamcellen worden gecombineerd met groeifactoren en gezaaid op draagstructuren om botvorming te induceren. Echter worden de huidige strategieën gehinderd door een gebrek aan robuuste en reproduceerbare cel populaties, die voldoende differentiatie en proliferatieve eigenschappen vertonen. Cellulaire herprogrammering kan een oplossing bieden voor de derivatie van robuuste cel populaties voor medicinaal onderzoek en klinische therapieën.

Cellulaire herprogrammering is een strategie waarbij cellen omgevormd kunnen worden tot alternatieve celtypes door de geforceerde expressie van transcriptie- factoren die de cellulaire functie bepalen. Activatie van deze factoren kan leiden tot de herintroductie van embryonale pluripotentie in terminale adulte gedifferentieerde celtypes en dus resulteren in de derivatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze stamcellen kunnen dan verder gespecialiseerd worden tot skeletale cellen voor botherstel (indirecte herprogrammering). Echter kan deze techniek aangepast worden zodat de cel naar keuze onmiddellijk bekomen kan worden door de geforceerde expressie van celtype specifieke transcriptiefactoren (directe herprogrammering). Beide strategieën zijn onderzocht in dit doctoraat en verschillende skeletale celtypes zijn hieruit voortgekomen voor botaugmentatie.

Muis huid fibroblast cellen werden direct geherprogrammeerd tot kraakbeen cellen (chondrocyten) door het gebruik van Sox9, KLF4 en cMYC. Twee cellijnen werden bekomen door ofwel een constitutieve ofwel een doxycycline induceerbare expressie van deze transcriptiefactoren. Hoewel beide cellijnen in vitro kraakbeenvorming konden ondergaan, ondergingen slechts cellen met een induceerbare expressie hypertrofische maturatie en endochondrale botvorming.

Deze bevindingen werden vertaald naar humane cel types. Humane (geïnduceerde) pluripotente stamcellen werden gedifferentieerd naar kraakbeen aggregaten. Vervolgens werden deze hypertrofisch gestimuleerd en zacht callus-achtig weefsel werd bekomen. Na implantatie van deze aggregaten in grote botdefecten, werd progressieve heling geobserveerd. Deze bevindingen ondersteunen het concept van weefselontwikkelingsengineering strategieën voor botherstel.

In het laatste gedeelte van dit doctoraat werd aangetoond dat embryonale ledemaat voorlopercellen in vitro geëxpandeerd konden worden. Na implantatie van deze cellen, werd er spontane endochondrale botvorming geobserveerd. Om deze bevindingen te vertalen naar klinische omstandigheden, werden cultuur- en differentiatie condities geoptimaliseerd waarbij embryonale ledemaat voorlopercellen konden afgeleid worden van geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze experimenten tonen het potentieel van cellulaire herprogrammering aan, waarbij skeletale voorlopers aangemaakt kunnen worden voor nieuwe botweefsel engineering strategieën.

Samenvattend leveren de bevindingen van dit doctoraat niet alleen een bijdrage aan skeletaal weefselherstel en stamcelbiologie maar demonstreren ze de mogelijkheden van cellulaire herprogrammering voor de derivatie van nieuwe stamcelpopulaties voor botherstel.