< Terug naar vorige pagina

Project

Ionische vloeistoffen als veelbelovende solventen voor vloeistof-vloeistof micro-extracties in forensische toxicologie

Vluchtige organische solventen (VOSs) worden wereldwijd gebruikt in staal-voorbereidingsprocessen. In bioanalytische toepassingen worden ze in grote hoeveelheden aangekocht, gezien staalvoorbereiding hier een onmisbare stap is. Biologische stalen bezitten namelijk een grote hoeveelheid endogene matrix-componenten (e.g. proteïnen, vetten) die kunnen leiden tot onderdrukking van het analietsignaal en kwantificatiefouten. Als een gevolg van de toenemende bewustwording voor groene technieken gaat men op zoek naar alternatieven voor deze VOSs. In dit opzicht worden ionische vloeistoffen (ILs) uitvoerig bestudeerd. Het zijn vloeibare zouten met lage dampspanningen, hoge thermische stabiliteit en lage ontvlambaarheid. Verder kan hun chemische structuur makkelijk aangepast worden om zo ILs te bekomen met specifieke fysicochemische eigenschappen en een verhoogde affiniteit voor de extractie van het gewenste analiet.

Dit doctoraal onderzoeksproject heeft als doel ILs te introduceren in de forensische toxicologie. Hierbij werd de klemtoon gelegd op de ontwikkeling van analytische methodes voor grote groepen van forensisch relevante stoffen, zoals benzodiazepines (BZDs) en antidepressiva (ADs). Verder werd de analyse van postmortem bloedstalen en de ongewenste extractie van proteïnen nagegaan. Als laatste onderzoekstopic werd de mogelijkheid bekeken om rationeel, taakspecifieke ionische vloeistoffen (TSILs) te creëren met een verhoogde affiniteit voor BZDs in extracties.

In Hoofdstuk III werd een methode ontwikkeld voor de extractie van 17 BZDs en 2 Z-drugs in volbloedstalen. De methode bestaat uit een IL-gebaseerde dispersieve vloeistof-vloeistof microextractie (IL-DLLME) in combinatie met vloeistof-chromatografie – tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS). De optimalisatie omvatte o.a. de bepaling van het type en volume van IL, de tijd en techniek nodig voor het bekomen van een fijne dispersie en de verdunning van het IL-extract alvorens analyse. De 30-min durende IL-DLLME-methode werd gekoppeld aan LC-MS/MS en gevalideerd volgens internationale richtlijnen. Dit had als resultaat een accurate en herhaalbare methode voor de kwantificatie van laag therapeutische tot laag toxische BZD-concentraties in volbloed.

De gevalideerde IL-DLLME-LC-MS/MS-methode werd in Hoofdstuk IV vergeleken met een gevestigde vaste fase extractie (SPE)-LC-MS/MS-methode voor de kwantificatie van BZDs in postmortem volbloed. Een Bland-Altman analyse werd uitgevoerd op basis van 11 forenische zaken. Beide methodes gaven vergelijkbare resultaten, hoewel er voor sommige BZDs toch afwijkende waarden werden geobserveerd, ondanks aanvaardbare validatieresultaten. Een plausibele verklaring voor deze afwijkingen zou kunnen zijn; de afwezigheid van postmortem bloed tijdens IL-DLLME-LC-MS/MS validatiestudies of het gebrek aan een gepaste gedeutereerde interne standaard in de SPE-LC-MS/MS-methode.

In Hoofdstuk V werd een IL-DLLME-LC-MS/MS-methode ontwikkeld voor de kwantificatie van 18 ADs. Optimalisatie en validatie verliepen analoog aan Hoofdstuk III. Als resultaat werd een accurate en herhaalbare methode bekomen voor de kwantificatie van laag therapeutische tot laag toxische AD-concentraties in volbloed.

Hoofdstuk VI biedt inzichten in het rationele ontwerp van een forensisch relevante TSIL voor de extractie van BZDs en Z-drugs in volbloedstalen. Elf commercieel beschikbare ILs werden vergeleken en structuur-extratie relaties werden bestudeerd om uiteindelijk een aantal gewenste eigenschappen voor de ideale TSIL te definiëren. Het belang van lage IL-viscositeit, korte alkyl-substituenten, aromatische functionaliteit en de afwezigheid van aromatische substitutie werd aangetoond.

In voorgaande hoofdstukken werden hoge matrixeffecten geobserveerd. Deze konden gelinkt worden aan de aanwezigheid van IL tijdens de analytische run. Naast IL, werd de ongewenste aanwezigheid van proteïnen in het finale extract ook als een potentiële oorzaak van de onderdrukking van het ionisatieproces onderzocht. In Hoofdstuk VII werden IL-DLLME, SPE en proteïneprecipitatie (PP) extracten vergeleken op basis van de aanwezigheid van proteïnen, gebruikmakende van natriumdodecylsulfaat – polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE). Verder werden matrixeffecten bepaald en vergeleken voor de extractie van BZDs in water en volbloed m.b.v. IL-DLLME-LC-MS/MS. Uit de resultaten werd besloten dat er geen relevante bijdrage is van ongewenste proteïne-extractie aan de geobserveerde matrixeffecten.

In Hoofdstuk VIII werd de toepasbaarheid van ILs nagegaan als extractiesolvent in de staalvoorbereiding voor de algemene screening op drugs. Een screeningsmethode moet in staat zijn een brede waaier van stoffen met verschillende polariteit te extraheren en analyseren. Dit is een grote uitdaging voor IL-DLLME-toepassingen, gezien voorgaand onderzoek heeft aangetoond dat de IL gelijktijdig elueert met polaire stoffen op omgekeerde fase vloeistofchromatografie (RPLC) en dus voor een grote onderdrukking van hun signaal zorgt. Hydrofiele interactie vloeistofchromatografie (HILIC) werd preliminair geëvalueerd als een mogelijke oplossing voor de scheiding van IL en polair analiet.

Samengevat geeft deze doctorale thesis een eerste evaluatie van de toepasbaarheid van ILs als extractiesolventen in de forensische toxicologie. Twee snelle en eenvoudige multi-analiet IL-DLLME-LC-MS/MS-methoden werden succesvol ontwikkeld en gevalideerd voor de kwantificatie van BZDs en ADs in volbloed. Het gebruik van deze IL-DLLME-methode werd ook aangetoond voor de analyse van postmortem stalen. Verder werden enkele fysicochemische IL-eigenschappen voorgesteld die gunstig zijn voor de extractie van BZDs uit volbloed. Ongewenste proteïne-extractie bleek geen effect te hebben op het matrix effect en de eerste stappen voor de implementatie van ILs in drugscreening-applicaties werden gezet. Toekomstig onderzoek moet zich toespitsen op het vinden van oplossingen voor de geobserveerde onderdrukking van het electrospray ionisatieproces, dat voortkomt uit het gelijktijdig elueren van IL en analiet. Als laatste moet TSIL-onderzoek voor de extractie van BZDs verder worden uitgewerkt op basis van de dusver verkregen resultaten.

Datum:25 aug 2014 →  5 jul 2018
Trefwoorden:Ionic liquid, LC-MS/MS, Liquid-liquid microextraction, Forensic toxicology
Disciplines:Ontdekking en evaluatie van biomarkers, Ontdekking en evaluatie van geneesmiddelen, Medicinale producten, Farmaceutica, Farmacognosie en fytochemie, Farmacologie, Farmacotherapie, Toxicologie en toxinologie, Andere farmaceutische wetenschappen
Project type:PhD project