Invloed van micro-organismen op het gedrag en de differentiatie van intestinale stamcellen bij inflammatoire darmziekten.

Inflammatoire darmziekten (IBD) zijn chronische, progressieve aandoeningen van het gastro-intestinale stelsel. De twee meest voorkomende vormen zijn colitis ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn (CD). De exacte oorzaak van deze ziekten is ongekend, maar er wordt gesuggereerd dat milieufactoren, zoals microbiota, in een genetisch voorbeschikte patiënt aanleiding kunnen geven tot een overmatige immuunreactie en de ontwikkeling van IBD. Huidige therapieën stoppen of remmen de inflammatoire respons. De meest toegepaste therapie zover is anti-tumor necrosis factor (TNF), maar tal van nieuwe therapieën worden beschikbaar (anti-adhesie, anti-interleukine- (IL-) 12/23, anti-janus kinase antistoffen). Veel patiënten (tot 30% bij anti-TNF) zijn primair niet-responsief, terwijl nog eens zo veel patiënten over tijd hun respons verliezen. Dit belicht de grote noodzaak om de ziekte beter te begrijpen, om een langdurigere en betere behandeling mogelijk te maken.

De microbiota spelen een belangrijke rol in onze gezondheid. Een dysbiosis is gelinkt aan IBD, met een vergrote aanwezigheid van ontstekingsbevorderende soorten, of een afwezigheid van ontstekingsremmende bacteriën. Bovendien is het mogelijk dat patiënten met IBD een verzwakte mucosale barrière hebben. Hierdoor kan een influx van bacteriën richting en doorheen het epitheel plaatsvinden. Het darmepitheel bestaat uit crypten en villi structuren, hoewel villi afwezig zijn in het colon. Aan de basis van de crypten bevinden zich de Leucine Rich Repeat Containing G Protein-Coupled Receptor 5 (LGR5)+ intestinale stamcellen (ISCs). Door neutrale drift migreren de ISCs naar boven, en ondergaan differentiatie naar de verschillende type cellen van het epitheel. In patiënten met IBD kan er door een verminderde barrièrefunctie contact optreden tussen ISCs en bacteriën. Er is nog maar weinig gekend over deze mogelijke interactie.

In dit project hebben we daarom onderzocht of organoids, een ISC-cultuurmodel, gebruikt kunnen worden in onderzoek naar IBD, en om in een later stadium de interactie met bacteriën te bestuderen. Intestinale organoids zijn zelf-organiserende 3D structuren die in Matrigel (vervanging van de extracellulaire matrix) langdurige expansie ondergaan en genetisch stabiel blijven, onder de juiste groeifactoren zoals Wnt family member 3A (WNT3A), R-spondin-1, noggin, epidermal growth factor, etc.

We hebben een organoid databank gecreëerd door middel van crypt isolatie van mucosale biopsies van patiënten met IBD en controle patiënten. Als eerste keken we naar de efficiëntie van de groei van organoids uit crypten, en zagen op dit vlak geen verschillen tussen patiënten met IBD en controles. Wel observeerden we een trend naar verminderde organoid vorming van biopten uit een inflammatoir milieu.

In een volgend experiment werden organoids minimaal 2 weken in cultuur gehouden, waarnaar we een differentiatie-experiment uitvoerden waarin ISCs in organoids kunnen uitgroeien tot de verschillende epitheliale cellen. In gedifferentieerde organoids kwam MUCIN2 (een goblet cell merker) lager tot expressie in organoids van patiënten met CD t.o.v. controles. De transcriptiefactor atonal bHLH Transcription Factor 1 (ATOH1), bevorderend voor differentiatie naar secreterende cellen, kwam minder tot expressie in gedifferentieerde organoids van IBD patiënten vs. controles. Er was een significante toename in expressie van tight junction protein 1 (TJP1) in UC organoids, en een trend naar toename in CD organoids. Patiënten met IBD kunnen een verlaagde barrièrefunctie hebben, waarmee deze bevinding contrasteert. Het is mogelijk dat andere eiwitten betrokken in cel-tot-cel adhesie minder tot expressie komen, waarvoor TJP1 probeert te compenseren. Verder vergeleken we colon en ileum organoids, en zagen dat villin-1, alkaline phosphatase (enterocyt-merker) en chromogranine A (entero-endocriene cel merker) hoger tot expressie kwamen in ileum organoids. Dit laat zien dat locatie-specifieke expressie ex vivo behouden blijft, zoals al eerder gerapporteerd is.

Om mRNA data te bevestigen, kleurden we via immunohistochemie bepaalde merkers in organoids aan, zoals MUCIN2. Door heterogeniteit in de gedifferentieerde organoids konden we geen duidelijk verschil kwantificeren m.b.v. een sectiescanner. Dit kan mogelijk verklaard worden omdat zelfs bij gedifferentieerde organoids in dezelfde well ook niet-gedifferentieerde organoids aanwezig zijn, maar mogelijks ook door verschillende batches cultuurmedium. Dit zal in de toekomst beter in detail moeten worden geanalyseerd.

Vervolgens hebben we bacteriële infectie gesimuleerd door organoids bloot te stellen aan lipopolysaccharide (LPS) en muramyl dipeptide (MDP), als ook de pro-inflammatoire cytokine TNFα. LPS noch MDP kon een inflammatoir reactie teweegbrengen op mRNA niveau in organoids na een blootstelling van 24 uur aan 3 concentraties (0.5 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml), terwijl 100 ng/ml TNFα verscheidene genen activeerde: C-X-C motif chemokine ligand (CXCL) 8 en 3, TNFα, Nuclear factor kappa B (NFκB) en 2 NFκB inhibitoren. Onze resultaten komen overeen met een eerder verslag over maag organoids. Deze organoids brachten ook geen CXCL8 tot expressie na blootstelling aan LPS, maar wel na blootstelling aan flagellines, TNFα, of een levende Helicobacter pylori cultuur.

Patiënten met IBD ondervinden ziekteopstoten, gevolgd door periodes van remissie. Het was niet gekend hoe inflammatoire merkers zich ontwikkelen vanuit biopsies naar organoids. Hiervoor werden patiënten geïncludeerd met actieve ziekte (macroscopisch vastgesteld tijdens endoscopie). Van patiënten werd zowel normaal als inflammatoir weefsel genomen voor het creëren van organoid culturen. Zoals verwacht was de ISC merker LGR5 toegenomen in organoids t.o.v. biopsies. Merkers van inflammatie, IL1β en TNFα kwamen hoger tot expressie in biopten van IBD patiënten, en die expressie nam af in organoids. Daarentegen zagen we een toename in CXCL8 in alle groepen voor organoids vs. biopsies, wat suggereert dat onze cultuurcondities dit mogelijk induceren. CXCL3 expressie was grotendeels gelijk aan CXCL8, buiten een afname van expressie in organoids t.o.v. biopsies in de IBD-groepen met actieve inflammatie. Een belangrijke observatie was het gelijke expressie niveau in organoids tussen de IBD-groepen en controles voor alle geteste merkers. Dit experiment was ook uitgevoerd voor ileum, waarbij we gelijkaardige expressie patronen zagen. Organoids van patiënten met IBD komen dus snel op gelijke expressie niveaus wat betreft de inflammatoire merkers als die van controles, maar het moet nog vastgesteld worden dat de expressie in biopten van het epitheel is, en niet van immuuncellen.

Organoids zijn een geschikt systeem om het effect van microbiota op ISCs te testen, maar deze bevatten geen andere celtypes zoals immuuncellen. Daarom hebben we ook een muismodel van colitis gebruikt. Hierin kregen muizen gedurende 5 dagen 2.5% dextraan-natriumsulfaat in drinkwater, waarna ze colitis ontwikkelen. Zoals eerder werd beschreven zagen wij ook dat LGR5 expressie sterk verlaagd was na DSS-colitis, en op dag 12 was dit nog niet volledig hersteld. Musashi RNA-binding protein 1 (Msi1) is een merker van reserve ISCs, en kwam zoals LGR5 minder tot expressie. De inflammatoire merker TNFα had een piekmoment van expressie direct na 5 dagen DSS, terwijl het sterk verlaagd was 7 dagen na stopzetten van DSS-blootstelling. Interferon gamma (IFNγ) en IL1β hadden daarentegen hogere expressie op 7 dagen na stopzetten van DSS-blootstelling. Dit duidt mogelijk op een primair TNFα gestuurde inflammatie, gevolgd door een adaptieve, TH-gestuurde immuniteit. Bovendien kan IL1β kan ook een rol hebben in epitheliaal herstel.

In conclusie, organoids van patiënten met IBD hebben grotendeels gelijke transcriptionele profielen als organoids van controle patiënten. Er waren enkele verschillen in gedifferentieerde organoids. Door grote heterogeniteit in de differentiatie kon dit echter niet bevestigd worden met immunohistochemie. Verder hebben we aangetoond dat organoids verkregen van weefsel uit inflammatoir weefsel snel een basisniveau van expressie gelijk aan controles aannemen, terwijl CXCL3 en CXCL8 door het medium tot expressie lijken te komen.

We hebben een organoid databank opgezet van controles en patiënten met IBD, die in de toekomst gebruikt kunnen worden voor het verder karakteriseren van de respons van organoids met verschillende genetische achtergronden na blootstelling aan microbiële of andere stimuli.