< Terug naar vorige pagina

Project

INNOVATIEVE NUCLEÏNEZUURGEBASEERDE STRATEGIEËN VOOR FIBER OPTIC SURFACE PLASMON RESONANCE BIOSENSORDESIGN

De diverse informatie die vervat ligt in de specifieke sequentie van DNA-moleculen is een belangrijke drijfveer in onze kennis en inzichten in de erfelijkheid van ziekten, hun verspreiding en evolutie. Ultragevoelige detectie van deze DNA-moleculen is cruciaal voor de vroegtijdige detectie van verschillende ziekten, vermits dit de minimalisatie van de werkelijke ziektelast vergemakkelijkt. Standaardreferentietechnieken, zoals de polymerase kettingreactie (PCR), zijn hoofdzakelijk beperkt tot geavanceerde laboratoria, die afhankelijk zijn van getraind personeel, omvangrijke toestellen en een groot aantal stalen. Om de toegankelijkheid van nucleïnezuur (NZ) -analyses te verbeteren en zijn waardevolle informatie buiten deze geavanceerde instellingen te kunnen aanbieden, worden er biosensoren ontwikkeld. Deze biosensoren kunnen gebruiksvriendelijkere, robuustere, snellere en kostenefficiëntere apparaten leveren en richten zich daarbij op de behoeften van de eindgebruiker. Bovendien beperken biosensoren zich niet tot het gebruik van DNA als doelwitmolecule. In plaats daarvan wordt de unieke structuur van DNA ook gebruikt als bouwsteen voor het slimme ontwerp van biosensoren.

Fiber optic surface plasmon resonance (FO-SPR) is een massagevoelige biosensingtechniek met enkele voordelige kenmerken, zoals zijn real-time aspect, gebruiksvriendelijkheid en snelle analyse. Hoewel deze FO-SPR-kenmerken overeenkomen met verschillende van de hierboven genoemde behoeften, zijn NZ-gebaseerde FO-SPR-tests voornamelijk beperkt tot klassieke hybridisatiestrategieën. Dit beperkt hun gevoeligheid tot het lagere nM-concentratiebereik. Ultragevoelige detectie van NZ blijft een uitdaging en alternatieve ontwerpen om het signaal te genereren en versterken zijn nog te weinig onderzocht.

Opkomende onderzoeksgebieden, zoals DNA-nanotechnologie, stimuleren dergelijke innovatieve ontwerpen door de ontdekking van nieuwe functionele moleculen, zoals DNAzymes. Deze enzymachtige moleculen zijn van groot belang voor de ontwikkeling van biosensoren vanwege hun gemakkelijke koppeling aan bestaande signaal genererende systemen en inherente amplificatie. Vanwege hun NZ-gebaseerde structuur zijn ze stabieler, kostenefficiënter en vertonen ze een superieure flexibiliteit, in vergelijking met hun eiwittegenhangers, in hun herontwerp naar andere doelmoleculen. DNA-nanotechnologie is echter verre van volledig ontwikkeld en oppervlakte-gebaseerde DNAzyme-strategieën hebben zich geconcentreerd op metaaliondetectie. NZ- en eiwittoepassingen zijn schaars en vereisen een geavanceerder ontwerp en implementatie van de huidige DNAzyme-gebaseerde strategieën.

In dit kader was het hoofddoel van dit proefschrift het ontwerp van innovatieve, NZ-gebaseerde strategieën met behulp van een FO-SPR-platform voor de gevoelige en specifieke detectie van NZ. Om dit te doen, werden drie verschillende NZ-gebaseerde strategieën gepresenteerd: (i) een FO-PCR smelttest, ii) een FO-SPR-sensorontwerp, gevoelig voor katalytische DNAzyme-activiteit en (iii) een DNAzyme-gebaseerde FO-PCR test.

Het eerste ontwerp was gebaseerd op PCR-amplificatie van de doelsequenties, die vervolgens hybridiseerden aan het FO-sensoroppervlak en met DNA-gefunctionaliseerde gouden nanodeeltjes (AuNP's) voor amplificatie. Als proof-of-concept werd de test onderzocht voor de detectie van selderij-DNA, een van de belangrijkste oorzaken van voedingsallergieën. Verschillende concentraties selderij-DNA (1 pM – 0,1 fM) werden gedetecteerd en een aansluitende smeltstap maakte het mogelijk om een onderscheid te maken tussen nauw verwante sequenties, zoals wortel-DNA. Het concept werd gevalideerd in reinigingswaterstalen en vergeleken met een referentie qPCR gevolgd door smeltstap met hoge resolutie. Deze vergelijking vertoonde een uitstekende overeenstemming (R² = 0,96). Op deze manier bood de FO-PCR smelttest een snelle en eenvoudige detectiemethode, geschikt voor éénstapskwantificatie en discriminatie van enkelstrengig DNA (ssDNA) met een groot potentieel in toepassingsgebieden zoals voedselkwaliteit en -veiligheid.

Voor het tweede ontwerp werd er eerst een robuuste ligatiestrategie ontwikkeld om het FO-SPR-detectieoppervlak te functionaliseren met ssDNA. Dit ssDNA was op zijn beurt gelabeld met AuNP's om als DNAzyme-substraat te fungeren. Vervolgens onderzochten we de relatie tussen de verandering in FO-SPR-shift en de DNAzyme-splitsingsactiviteit, wat een snellere splitsingskinetiek vertoonde voor hogere DNAzyme-concentraties. Ten slotte hebben we deze real-time splitsingsactiviteit vertaald naar een generiek biosensingconcept voor de detectie van ssDNA-doelwitmoleculen. Een DNA-inhibitiecomplex werd ontworpen om actieve DNAzymes vrij te geven op een gecontroleerde manier en in functie van de concentratie van de doelwitsequentie. Reproduceerbare detectie van de doelwitsequentie werd aangetoond met een theoretische detectielimiet (LOD) van 1,4 nM. Kortom, een innovatieve, DNAzyme-gebaseerde FO-SPR-biosensor werd verwezenlijkt met groot potentieel om te fungeren als universele sensor in veelbelovende toepassingen in de medische en agrofoodsector.

Het laatste ontwerp in dit proefschrift combineerde inzichten uit zowel het eerste als het tweede ontwerp door de katalytische splitsingsactiviteit te versterken via PCR-amplificatie van de DNAzymes. Gebaseerd op het uitleessysteem van het tweede design, werd de splitsingsefficiëntie van met DNAzyme-verlengde amplicons (DNAzyme-amp’s) aan het sensoroppervlak eerst geëvalueerd en bevestigd. Vervolgens werden de PCR- en splitsingsreactieomstandigheden verfijnd om compatibiliteit met het FO-SPR-systeem te verzekeren en een éénstapsreactie te bekomen. Als proof-of-concept werd het primerpaar met ingebouwd DNAzyme-complement getest voor de detectie van het antimicrobiële resistentiegen MCR-2. PCR-geamplificeerde DNAzyme-amp’s, die gegenereerd werden in aanwezigheid van het MCR-2-gen, werden in real-time gevolgd, wat resulteerde in een experimentele LOD van 4 × 10^5 kopieën van het gen of 6,6 fM. Bovendien was de DNAzyme-gebaseerde FO-PCR-test in staat om onderscheid te maken tussen het MCR-1- en MCR-2-gen, wat de specificiteit van deze test verder illustreert. Kortom, deze DNAzyme-gebaseerde FO-PCR-test bood een universeel toepasbaar, real-time systeem voor de detectie van vrijwel elk NZ-doelwit, op een specifieke en gevoelige manier.

Datum:17 sep 2015 →  25 mei 2020
Trefwoorden:MNAzyme based bioassays, Optical aptasensors, Ultrasensitive biosensors
Disciplines:Diagnostiek, Laboratoriumgeneeskunde, Medicinale producten
Project type:PhD project