< Terug naar vorige pagina
Project
Identificatie van nieuwe Salmonella biofilm inhibitoren via een 'bottom-up' en een 'top-down' benadering.
Een belangrijk probleem in de bestrijding van Salmonella</>, enbij uitbreiding van alle bacterie soorten, is het feit dat ze in staat zijn om multi-cellulaire, oppervlakte geassocieerde structuren te vormendie biofilmen worden genoemd. In dergelijke biofilmen zijn de bacteriënomgeven door een zelf aangemaakte slijmlaag (de biofilm matrix) en zijnze beschermd tegen allerlei stressfactoren, zoals antibiotica, ontsmettingsmiddelen en het immuunsysteem. De identificatie van nieuwe en effectieve anti-biofilm componenten was daarom het belangrijkste doel van dezethesis. Vermits bacteriën in zowat elke omgeving een biofilm kunnen vormen en de regulatie en samenstelling van de biofilm(matrix) sterk kan variëren naargelang de groei-omgeving, was het daarnaast ook van groot belang dat de inhibitoren toepasbaar zijn in verschillende omgevingen, bij verschillende temperaturen en tegen verschillende bacteriële species. Een laatste, en essentiële eigenschap van de nieuwe inhibitoren is dat ze enkel een biofilm specifieke activiteit mogen vertonen, zonder daarbij de (planktonische) groei van de bacteriën te verminderen. Dit om de ontwikkeling van resistentie te voorkomen of tenminste te vertragen.
Voor de identificatie van de breed toepasbare en biofilm specifieke componenten werden twee componentbibliotheken gescreend. De meest uitgebreide bibliotheek, welke ook het grootste deel van deze thesis uitmaakt, werd geleverd door het Centre for Drug Design and Discovery (CD3) en bestaat uit meer dan 20.000 kleine moleculen. De bibliotheek werd gescreend voor de preventie van Salmonella biofilmvorming, zowel bij 16 °C als bij37 °C, wat resulteerde in de initiële identificatie van 140 hits. Na bevestiging en verdere karakterisatie werden 11 veelbelovende families geselecteerd met een breed toepasbare en biofilm-specifieke activiteit. Per familie werden vervolgens ongeveer 20 commercieel beschikbare analogen besteld om zo een eerste structuur-activiteit relatie (SAR) te bepalen. De drie meest veelbelovende families werden vervolgens in meer detail bestudeerd, in combinatie met in totaal negen verschillende bacteriesoorten.
Een tweede, minder uitgebreide, bibliotheek die gescreend werd in deze thesis bevat in totaal 672 synthetische peptiden, nagemaakt op basis van natuurlijk geïsoleerde peptiden, voornamelijk afkomstig vanweefsel- en lichaamsvloeistoffen van mens en muis. Deze screening resulteerde in de identificatie van vijf peptiden met veelbelovende eigenschappen voor de verdere ontwikkeling tot (specifieke) anti-biofilm strategieën.
Naast de identificatie en karakterisatie van de activiteit, werd ook het werkingsmechanisme (mode of action) van de inhibitoren bepaald. Deze kennis van het werkingsmechanisme kan bijdragen aan de verdere optimalisatie van de activiteit en specificiteit van de biofilminhibitoren. De bepaling van het werkingsmechanisme kan ook nieuwe fundamentele inzichten leveren i.v.m. belangrijke bacteriële biofilm processen. Deze kennis kan op zijn beurt gebruikt worden voor de ontwikkeling van nieuwe,en mogelijk nog actievere, anti-biofilm strategieën.
Omdat de regulatie en samenstelling van een bacteriële biofilm sterk afhankelijk isvan de groei-omstandigheden, is het essentieel dat dergelijke mode of action studies uitgevoerd worden in verschillende condities en dit op een tijdsafhankelijke manier. Om dit te kunnen verwezenlijken werd, gebruikmakend van een reporterfusie bibliotheek, een snel en gemakkelijk toegankelijk assay ontwikkeld. Deze GFP (groen fluorescent proteïne) gebaseerde bibliotheek bevat momenteel 78 promoterfusies van belangrijke biofilm- gerelateerde genen, waaronder genen betrokken bij de matrix productie, beweeglijkheid, virulentie, quorum sensing en metabolische processen.
Deze reporterfusie bibliotheek werd gebruikt voor de mode of action bepaling, in vier verschillende groeicondities (bij 16 °C, 37 °C, beide in statische and schuddende condities), van de twee meest belovende kleine-moleculenfamilies. Dit resulteerde onder andere in de identificatie van inhiberende effecten op de biofilm meesterregulator CsgD. Deze inhibitie verliep ofwel via preventie van de transcriptie of via interferentie met de translatie of de werking van het CsgD proteïne. In beide gevallen leidde dit tot een vermindering van de expressie van csgB</> (belangrijk voor de synthese van curli fimbriae) en adrA</> (een regulator van de cellulose biosynthese). Zowel de curli fimbriae als cellulose zijn belangrijke onderdelen van de biofilm matrix enhun inhibitie is vermoedelijk één van de belangrijkste bijdragen aan het werkingsmechanisme van de inhibitoren. Daarnaast werden ook verschillende aanhechtingsmechanismen en bewegelijkheidsregulatoren beïnvloeddoor de componenten.
Beide component families zorgden ook voor belangrijke veranderingen in de expressie van verschillende metabolische processen, zoals vermindering van mechanismen voor ijzer opname en veranderingen in het stikstofmetabolisme. Dit kan, of het resultaat zijn van de directe werking van de componenten (via blokkering van bepaalde metabolische processen), of het gevolg zijn van de verminderde biofilmvorming (via andere processen) en de daardoor verschillende nutriëntbenodigdheden van de bacteriën. Verdere studies zijn nodig om met zekerheid oorzaak en gevolg te bepalen.
Daarnaast bleken alle onderzochte componenten tenminste twee verschillende reactiewegen in de Salmonella</> biofilm vorming te beïnvloeden, wat bijkomend bijdraagt aan het voorkomen van resistentie ontwikkeling tegen de componenten.
Samenvattend werden in dit doctoraal onderzoek verschillende, krachtige anti-biofilm componenten geïdentificeerd, welke veelbelovend zijn voor verdereoptimalisatie naar verschillende toepassingsmogelijkheden. De studie van hun werkingsmechanisme toonde aan dat verschillende reactiewegen beïnvloed werden, waaronder deze van de centrale biofilmregulator CsgD, aanhechtingsprocessen, verschillende bewegelijkheids- en virulentie- regulatoren en het bacteriële metabolisme.
Voor de identificatie van de breed toepasbare en biofilm specifieke componenten werden twee componentbibliotheken gescreend. De meest uitgebreide bibliotheek, welke ook het grootste deel van deze thesis uitmaakt, werd geleverd door het Centre for Drug Design and Discovery (CD3) en bestaat uit meer dan 20.000 kleine moleculen. De bibliotheek werd gescreend voor de preventie van Salmonella biofilmvorming, zowel bij 16 °C als bij37 °C, wat resulteerde in de initiële identificatie van 140 hits. Na bevestiging en verdere karakterisatie werden 11 veelbelovende families geselecteerd met een breed toepasbare en biofilm-specifieke activiteit. Per familie werden vervolgens ongeveer 20 commercieel beschikbare analogen besteld om zo een eerste structuur-activiteit relatie (SAR) te bepalen. De drie meest veelbelovende families werden vervolgens in meer detail bestudeerd, in combinatie met in totaal negen verschillende bacteriesoorten.
Een tweede, minder uitgebreide, bibliotheek die gescreend werd in deze thesis bevat in totaal 672 synthetische peptiden, nagemaakt op basis van natuurlijk geïsoleerde peptiden, voornamelijk afkomstig vanweefsel- en lichaamsvloeistoffen van mens en muis. Deze screening resulteerde in de identificatie van vijf peptiden met veelbelovende eigenschappen voor de verdere ontwikkeling tot (specifieke) anti-biofilm strategieën.
Naast de identificatie en karakterisatie van de activiteit, werd ook het werkingsmechanisme (mode of action) van de inhibitoren bepaald. Deze kennis van het werkingsmechanisme kan bijdragen aan de verdere optimalisatie van de activiteit en specificiteit van de biofilminhibitoren. De bepaling van het werkingsmechanisme kan ook nieuwe fundamentele inzichten leveren i.v.m. belangrijke bacteriële biofilm processen. Deze kennis kan op zijn beurt gebruikt worden voor de ontwikkeling van nieuwe,en mogelijk nog actievere, anti-biofilm strategieën.
Omdat de regulatie en samenstelling van een bacteriële biofilm sterk afhankelijk isvan de groei-omstandigheden, is het essentieel dat dergelijke mode of action studies uitgevoerd worden in verschillende condities en dit op een tijdsafhankelijke manier. Om dit te kunnen verwezenlijken werd, gebruikmakend van een reporterfusie bibliotheek, een snel en gemakkelijk toegankelijk assay ontwikkeld. Deze GFP (groen fluorescent proteïne) gebaseerde bibliotheek bevat momenteel 78 promoterfusies van belangrijke biofilm- gerelateerde genen, waaronder genen betrokken bij de matrix productie, beweeglijkheid, virulentie, quorum sensing en metabolische processen.
Deze reporterfusie bibliotheek werd gebruikt voor de mode of action bepaling, in vier verschillende groeicondities (bij 16 °C, 37 °C, beide in statische and schuddende condities), van de twee meest belovende kleine-moleculenfamilies. Dit resulteerde onder andere in de identificatie van inhiberende effecten op de biofilm meesterregulator CsgD. Deze inhibitie verliep ofwel via preventie van de transcriptie of via interferentie met de translatie of de werking van het CsgD proteïne. In beide gevallen leidde dit tot een vermindering van de expressie van csgB</> (belangrijk voor de synthese van curli fimbriae) en adrA</> (een regulator van de cellulose biosynthese). Zowel de curli fimbriae als cellulose zijn belangrijke onderdelen van de biofilm matrix enhun inhibitie is vermoedelijk één van de belangrijkste bijdragen aan het werkingsmechanisme van de inhibitoren. Daarnaast werden ook verschillende aanhechtingsmechanismen en bewegelijkheidsregulatoren beïnvloeddoor de componenten.
Beide component families zorgden ook voor belangrijke veranderingen in de expressie van verschillende metabolische processen, zoals vermindering van mechanismen voor ijzer opname en veranderingen in het stikstofmetabolisme. Dit kan, of het resultaat zijn van de directe werking van de componenten (via blokkering van bepaalde metabolische processen), of het gevolg zijn van de verminderde biofilmvorming (via andere processen) en de daardoor verschillende nutriëntbenodigdheden van de bacteriën. Verdere studies zijn nodig om met zekerheid oorzaak en gevolg te bepalen.
Daarnaast bleken alle onderzochte componenten tenminste twee verschillende reactiewegen in de Salmonella</> biofilm vorming te beïnvloeden, wat bijkomend bijdraagt aan het voorkomen van resistentie ontwikkeling tegen de componenten.
Samenvattend werden in dit doctoraal onderzoek verschillende, krachtige anti-biofilm componenten geïdentificeerd, welke veelbelovend zijn voor verdereoptimalisatie naar verschillende toepassingsmogelijkheden. De studie van hun werkingsmechanisme toonde aan dat verschillende reactiewegen beïnvloed werden, waaronder deze van de centrale biofilmregulator CsgD, aanhechtingsprocessen, verschillende bewegelijkheids- en virulentie- regulatoren en het bacteriële metabolisme.
Datum:1 jan 2009 → 12 sep 2013
Trefwoorden:Salmonella, Biofilm, Biofilm inhibitors, Molecule library
Disciplines:Engineering van biomaterialen, Biologische systeemtechnologie, Biomateriaal engineering, Biomechanische ingenieurswetenschappen, Andere (bio)medische ingenieurswetenschappen, Milieu ingenieurswetenschappen en biotechnologie, Industriële biotechnologie, Andere biotechnologie, bio-en biosysteem ingenieurswetenschappen, Microbiologie, Systeembiologie, Laboratoriumgeneeskunde
Project type:PhD project