< Terug naar vorige pagina
Project
Identificatie en validatie van fysiologische substraten en eiwitinteractiepartners van PINK1 en LRRK2, 2 kinases gelinkt aan familiale vormen van de ziekte van Parkinson.
De ziekte van Parkinson (PD) is een veel voorkomende neurodegeneratieveaandoening die wereldwijd meer dan vier miljoen personen treft. Tot op heden zijn de exacte ontstaansmechanismen van PD nog niet volledig gekend. De huidige therapie verbetert de motor symptomen maar kan de progressie van de ziekte niet vertragen. In de afgelopen 17 jaar heeft de identificatie van mutaties in genen die PD kunnen veroorzaken enorm bijgedragen tot inzichten in de pathologie van PD. Wij geloven dat inspanningen omde moleculaire processen die aan de basis liggen van deze genetische vormen van PD beter te begrijpen, zal leiden tot de ontdekking van therapeutische strategieën. In 2004 zijn mutaties met een autosomaal recessief overervingspatroon in PINK1 geïdentificeerd in families met juveniele PD. PINK1 is ser/thr kinase met een N-terminaal mitochondriaal lokalisatiesignaal en een centraal kinase domein. Er werd aangetoond dat PINK1 eenrol speelt bij de regulatie van mitochondriale functie. Mutaties in LRRK2 zijn eveneens in 2004 geïdentificeerd als oorzaak van autosomaal dominante vormen van PD. LRRK2 is een complex, multi-domein eiwit bestaande uit twee katalytische domeinen (een kinase domein en een GTPase domein) en verschillende domeinen die betrokken zijn bij eiwit-eiwit interacties. LRRK2 behoort tot de familie van de Ras of complex (ROCO) eiwitten. Van de vier humane ROCO eiwitten is LRRK1 het meest homoloog aan LRRK2. Ondanks deze homologie is er tot op heden geen bewijs voor de associatievan mutaties in LRRK1 met PD. De exacte biologische functie van LRRK2 is niet helemaal duidelijk. Verschillende studies hebben het effect van LRRK2 op cellulaire toxiciteit onderzocht maar als gevolg van variatie ishet moeilijk hieruit een duidelijke conclusie te maken. Daarnaast werd aangetoond dat LRRK2 betrokken is bij de regulatie van neurietuitgroei. Om inzicht te krijgen in de signaaltransductie cascades waarin deze tweekinasen betrokken zijn hebben wij getracht cellulaire interactiepartners en fysiologische substraten van PINK1 en LRRK2 te identificeren aan dehand van verschillende proteoomanalyses.
In het eerste deel hebben we de cellulaire functies van LRRK1 en LRRK2 en een mogelijke functionele overlap tussen beiden bestudeerd door middel van identificatie van interactiepartners. Hiervoor hebben we gebruik gemaakt van een proteïne microarray techniek in combinatie met affiniteitsopzuiveringen uit cellysaten gekoppeld aan massa spectrometrie analyse. We toonden aan dat 14-3-3 eiwitten specifiek met LRRK2 interageerden, terwijl EGF-R een specifieke interactor van LRRK1 was. Deze waarnemingen waren in overeenstemmingmet identificatie van LRRK1 fosforylatieplaatsen buiten 14-3-3 consensus bindingsmotieven. Daarnaast hebben we ook aangetoond dat de cellulairerelokalisatie van LRRK2 na behandeling met LRRK2 kinase inhibitor IN1 en van LRRK1 na behandeling met EGF specifiek is voor elk LRRK eiwit en dat RNAi-gemedieerde neerregulatie van één van beide LRRK eiwitten geen effect had op deze waarnemingen. Onze resultaten suggereren dat er, ondanks een aantal gemeenschappelijke interactoren voor LRRK1 en LRRK2, geen functionele overlap is tussen de LRRK eiwitten op het niveau van detwee LRRK-specifieke interacties: LRRK1:EGF-R en LRRK2:14-3-3. Vervolgens hebben we getracht om LRRK2 substraten te identificeren uit muis hersenextracten via de zogenaamde chemical genetics strategie.
Deze techniek maakt het mogelijk om substraten van een bepaald kinase te identificeren in de context van een complexe cellulaire omgeving. Hiermeeidentificeerden we MARK1 als een substraat en toonden aan dat zowel in vitro als in levende cellen MARK1 wordt gefosforyleerd door LRRK2. MARK1is een ser/thr kinase dat de stabiliteit van microtubuli reguleert via de fosforylatie van microtubuli-geassocieerde eiwitten zoals tau. Op deze manier bieden onze resultaten een mogelijke verklaring voor de waargenomen effecten van LRRK2 op dynamiek van het cytoskelet.
Om de cellulaire processen waar PINK1 een rol speelt te ontrafelen hebben we twee verschillende proteoom technieken gebruikt. Ten eerste hebben we een 2D-DIGE studie uitgevoerd op mitochondriaal-aangerijkte hersenextracten van PINK1 KO muizen in vergelijking met controle dieren. We observeerden een vermindering in eiwitten die betrokken zijn bij energie metabolisme, cytoskelet en synaptische transmissie. Deze studie biedt een mogelijke verklaring voor de in de literatuur gerapporteerde vermindering in vrijgave van dopamine en totale hoeveelheid dopamine in het striatum vanPINK1 KO muizen. Ten tweede hebben we PINK1 interactiepartners geïdentificeerd. Hiervoor werd een strategie op punt gesteld waarbij PINK1 complexen werden geïsoleerd uit muis striatum en SH-SY5Y neuroblastoma cellijnen. Interessante kandidaten zijn getest op hun vermogen om de CCCP-geïnduceerde translocatie van parkine te wijzigen. We toonden aan dat neerregulatie van een aantal kandidaten een significant effect had op de translocatie van parkine. Hoewel bijkomende experimenten nodig zijn om de precieze rol van deze hits in PINK/parkine-gemedieerde mitofagie verder te bestuderen, zijn ze mogelijk een goed uitgangspunt voor het ontwikkelen van therapieën die zich richten tot het herstellen van mitofagie in PD.
In het eerste deel hebben we de cellulaire functies van LRRK1 en LRRK2 en een mogelijke functionele overlap tussen beiden bestudeerd door middel van identificatie van interactiepartners. Hiervoor hebben we gebruik gemaakt van een proteïne microarray techniek in combinatie met affiniteitsopzuiveringen uit cellysaten gekoppeld aan massa spectrometrie analyse. We toonden aan dat 14-3-3 eiwitten specifiek met LRRK2 interageerden, terwijl EGF-R een specifieke interactor van LRRK1 was. Deze waarnemingen waren in overeenstemmingmet identificatie van LRRK1 fosforylatieplaatsen buiten 14-3-3 consensus bindingsmotieven. Daarnaast hebben we ook aangetoond dat de cellulairerelokalisatie van LRRK2 na behandeling met LRRK2 kinase inhibitor IN1 en van LRRK1 na behandeling met EGF specifiek is voor elk LRRK eiwit en dat RNAi-gemedieerde neerregulatie van één van beide LRRK eiwitten geen effect had op deze waarnemingen. Onze resultaten suggereren dat er, ondanks een aantal gemeenschappelijke interactoren voor LRRK1 en LRRK2, geen functionele overlap is tussen de LRRK eiwitten op het niveau van detwee LRRK-specifieke interacties: LRRK1:EGF-R en LRRK2:14-3-3. Vervolgens hebben we getracht om LRRK2 substraten te identificeren uit muis hersenextracten via de zogenaamde chemical genetics strategie.
Deze techniek maakt het mogelijk om substraten van een bepaald kinase te identificeren in de context van een complexe cellulaire omgeving. Hiermeeidentificeerden we MARK1 als een substraat en toonden aan dat zowel in vitro als in levende cellen MARK1 wordt gefosforyleerd door LRRK2. MARK1is een ser/thr kinase dat de stabiliteit van microtubuli reguleert via de fosforylatie van microtubuli-geassocieerde eiwitten zoals tau. Op deze manier bieden onze resultaten een mogelijke verklaring voor de waargenomen effecten van LRRK2 op dynamiek van het cytoskelet.
Om de cellulaire processen waar PINK1 een rol speelt te ontrafelen hebben we twee verschillende proteoom technieken gebruikt. Ten eerste hebben we een 2D-DIGE studie uitgevoerd op mitochondriaal-aangerijkte hersenextracten van PINK1 KO muizen in vergelijking met controle dieren. We observeerden een vermindering in eiwitten die betrokken zijn bij energie metabolisme, cytoskelet en synaptische transmissie. Deze studie biedt een mogelijke verklaring voor de in de literatuur gerapporteerde vermindering in vrijgave van dopamine en totale hoeveelheid dopamine in het striatum vanPINK1 KO muizen. Ten tweede hebben we PINK1 interactiepartners geïdentificeerd. Hiervoor werd een strategie op punt gesteld waarbij PINK1 complexen werden geïsoleerd uit muis striatum en SH-SY5Y neuroblastoma cellijnen. Interessante kandidaten zijn getest op hun vermogen om de CCCP-geïnduceerde translocatie van parkine te wijzigen. We toonden aan dat neerregulatie van een aantal kandidaten een significant effect had op de translocatie van parkine. Hoewel bijkomende experimenten nodig zijn om de precieze rol van deze hits in PINK/parkine-gemedieerde mitofagie verder te bestuderen, zijn ze mogelijk een goed uitgangspunt voor het ontwikkelen van therapieën die zich richten tot het herstellen van mitofagie in PD.
Datum:1 okt 2009 → 29 sep 2014
Trefwoorden:Parkinson's disease
Disciplines:Biochemie en metabolisme, Medische biochemie en metabolisme, Neurowetenschappen, Biologische en fysiologische psychologie, Cognitieve wetenschappen en intelligente systemen, Ontwikkelingspsychologie en veroudering
Project type:PhD project