Het influenza virus endonuclease: een innovatief doelwit voor antivirale therapie.

Influenzavirussen veroorzaken zowel de seizoensgriep als pandemische uitbraken, geassocieerd met een enorme economische kost en aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit, in het bijzonder bij oudere of verzwakte personen. De wereldwijd aangeraden influenzavaccins vereisen jaarlijkse aanpassingen en bieden onvoldoende bescherming, vooral bij patiënten met een immuundeficiëntie en bejaarden, beiden een gestaag groeiende bevolkingsgroep. Daarenboven kan vaccinatie de onvoorspelbare pandemische dreiging geen halt toeroepen. Om een adequate bescherming te kunnen bieden, vormen antivirale medicijnen een onmisbare hoeksteen in de veelzijdige aanpak voor behandeling en preventie van griepinfecties, evenals in draaiboeken voor het beleid bij een dreigende of manifeste pandemie. De globale verspreiding van influenzavirussen die resistent zijn tegen de beschikbare antivirale producten, zelfs onder personen die deze geneesmiddelen niet krijgen, benadrukt de noodzaak aan nieuwe anti-influenza-geneesmiddelen met een volledig nieuw werkingsmechanisme. Het influenzapolymerasecomplex wordt algemeen erkend als een innovatief doelwit, vermits het onontbeerlijk is voor de virale replicatie en bijzonder sterk geconserveerd is onder influenza A (van humane of zoönotische oorsprong) en B virussen. De polymerase PA (‘polymerase acidic protein’)-subeenheid voert de ‘cap-snatching’ endonuclease-reactie uit, verantwoordelijk voor het klieven van gastheercel-pre-mRNA’s ter vorming van een gecapte primer voor virale mRNAsynthese. De activiteit van het influenza PA-endonuclease en de inhibitie ervan door PAinhibitoren (PAIs) om de influenzavirusreplicatie te blokkeren, vormen de focus van dit thesisproject.

De grondvesten van dit project werden gelegd toen we de bindingswijze onderzochten van de prototype PAI (L-742,001) in de actieve kern van PA. Dit β-diketo acid (DKA)-molecule werd reeds twee decennia geleden ontdekt door onderzoekers bij Merck, maar op dat moment werd de verdere ontwikkeling van PAIs aanzienlijk bemoeilijkt door het complete gebrek aan kennis over het doelwiteiwit. De opheldering van de kristalstructuur van het endonuclease katalytische centrum in het N-terminaal gedeelte van PA (PA-Nter) in 2009, stelde ons in staat om in silico docking van L-742,001 in het PA actieve centrum uit te voeren. Een uitgebreide mutatieanalyse werd uitgevoerd om de bindingswijze van L-742,001 te onthullen en te bepalen welke aminozuursubstituties in het katalytisch centrum van PA of de omliggende hydrofobe holtes, de antivirale gevoeligheid aan L-742,001 in celcultuur beïnvloeden. We opteerden bewust voor celcultuurmethodes, om een accuraat inzicht in de bindingswijze van het molecule te bekomen in een relevant virus-infectiemodel, in plaats van een systeem met het geïsoleerde PA-enzym. We stelden een hoog resistentieniveau vast (tot 20-voudig) voor mutaties l120T en H41A in de katalytische kern van PA-Nter, in overeenstemming met het concept dat de metaalchelatie door de bidentate DKA-farmacofoor een cruciale factor is voor endonuclease-inhibitie door L-742,001. Onze observatie dat een virus met de H41A-mutatie in PA kon repliceren, was totaal onverwacht, vermits het in tegenspraak is met de veronderstelling (die gebaseerd was op de PA-kristalstructuren en enzymtesten met geïsoleerde polymerasen) dat His41 onmisbaar is voor metaalchelatie en integriteit van de PAsubeenheid, en zelfs van het volledige polymerasecomplex. Mutaties van het Gly81-residu (naar Val, Phe of Thr) resulteerden in een minstens 9-voudige resistentie, wat suggereert dat Gly81 een hydrofobe interactie met de benzylgroep van L-742,001 zou kunnen aangaan of cruciaal kan zijn voor de vorm van de bindingsplaats van L-742,001. Voor PA-mutante virussen en virale ribonucleoproteïnes (vRNPs) met mutaties in de voorspelde hydrofobe bindingsholtes voor L-742,001, werd slechts een bescheiden resistentie tegen L-742,001 (maximum 5-voudig) waargenomen, wat kan verklaard worden door de suboptimale wijze waarop de aromatische zijketens van het molecule de voorspelde bindingsplaatsen innemen, zonder dat hierbij sterke bindingsinteracties gevormd worden. Bovendien wijzen onze resistentiedata op een rol voor Arg124, Val122 en Tyr130, die de voorgestelde bindingsplaats voor het RNA-substraat in PA omgeven; dit werd niet onderkend in vroegere cokristallisatie-experimenten door andere onderzoeksgroepen. Naast de bindingsmodus van L-742,001 leverde onze mutatieanalyse belangrijke informatie betreffende het tot op heden onontgonnen domein van het mogelijke PAI-resistentieprofiel, wat uitermate relevant is om te anticiperen op mogelijke resistentieontwikkeling bij toekomstige klinische toepassing van PAIs. De aminozuursubstituties die de activiteit van de gereconstitueerde vRNPs totaal tenietdoen, bevinden zich allemaal in het katalytische centrum van PA. Deze zwaar verminderde polymerase-activiteit impliceert dat het zeer onwaarschijnlijk is dat langdurige blootstelling aan L-742,001 of een andere PAI, virussen zou selecteren die (enkel) deze mutatie in hun PA-proteïne meedragen. Daarentegen hadden verschillende mutaties gelegen in niet-katalytische regio’s in PA geen of slechts een verwaarloosbaar effect op de enzymatische functionaliteit van virale ribonucleoproteïnecomplexen, in overeenstemming met de minder geconserveerde aard van deze PA-residu’s. Dus, een endonucleaseremmer geoptimaliseerd voor sterke binding aan één van deze residu’s, zou resistentie kunnen selecteren. Het is onmogelijk om te speculeren over de consequenties hiervan op de antivirale werkzaamheid van een dergelijke inhibitor. Onze biologische data tonen in ieder geval aan dat de structuur-gebaseerde ontwikkeling van PA inhibitoren altijd vergezeld moet gaan van celcultuurevaluatie tegen specifieke PA-mutante virussen, om het vooropgestelde werkingsmechanisme te verifiëren en te anticiperen op eventuele resistentie-ontwikkeling bij toekomstig klinisch gebruik.

Vervolgens legden we ons toe op de exploratie van een reeks DKA-gebaseerde moleculen die uiteenlopende structuren bevatten. Door analyse van hun structuur-activiteitsrelatie konden we een plausibel vijfpunten-3D-farmacofoor-model bouwen, dat strikte structurele vereisten definieert in combinatie met chemische eigenschappen. Verschillende DKA-analogen werden opgepikt die een potente inhibitie van PA-Nter veroorzaken met IC50-waarden die vergelijkbaar zijn met die van het prototype L-742,001. Drie moleculen (DKA-10, met een pyrroolstructuur, en DKA-40 en DKA-41, met een indoolstructuur) vertoonden een matige antivirale activiteit in celcultuur en hadden een bewezen effect op de virale RNA-synthese. Daarnaast ontwikkelden we een innovatieve ‘real time’ enzymatische test, gebaseerd op een fluorescent ‘molecular beacon’ (MB)-substraat, die inhibitiestudies op grotere schaal mogelijk maakt, en ons bovendien de opportuniteit gaf om de enzymkinetiek van PA-Nter te bestuderen. Met deze MB-test konden we overtuigend aantonen dat de set-up van de enzymatische assay (i.e. substraat, metaal-cofactor en uitleesopties) zorgvuldig gekozen moet worden tijdens PAIevaluatie. Terwijl de meeste enzymatische studies met geïsoleerd PA-Nter uitwezen dat het enzym aanzienlijk actiever is in aanwezigheid van Mn2+ in vergelijking met Mg2+, werkt onze MB-test even goed met Mg2+ als met Mn2+. Aangezien de intracellulaire concentratie van Mg2+ minstens 1000 keer hoger is dan die van Mn2+, zou magnesium biologisch relevanter kunnen zijn. Evaluatie van mogelijke PAIs tegen beide metalen (wat onze MB-test mogelijk maakt) lijkt daarom ten zeerste aangewezen. Voor de meeste hier geteste DKA-inhibitoren was de inhibitie van PA-Nter veel minder in aanwezigheid van Mg2+ dan met Mn2+, maar het prototype L-742,001 bleek een uniek profiel te bezitten met een zelfde activiteit tegen zowel Mg2+ als Mn2+. Dit kan impliceren dat PA-Nterexperimenten uitgevoerd met Mg2+ stringenter zijn voor de evaluatie van potentiële PAIs. Bovendien identificeerden we in de enzymatische testen vele PA-inhibitoren, terwijl slechts enkele van deze moleculen vervolgens antivirale activiteit vertoonden in influenzavirusgeïnfecteerde cellen. Dit benadrukt het belang van ‘proof-of-concept’ celcultuurvalidatie in een vroege fase van het ontdekkingsproces van potentiële PAIs. Daarom stellen we dat de PAIontwikkeling gestuurd moet worden in een allesomvattende aanpak die de integratie vormt van complementaire enzymatische, cellulaire en mechanistische studies.

In het laatste deel van ons project richtten we ons op de implementatie van onze vergaarde kennis en beoordeelden we diverse chemische klassen van potentiële metaal-chelerende PAIs, namelijk 2-hydroxybenzamides, thiosemicarbazones, N-acylhydrazones en dihydroxyindool-2- carboxamides. We combineerden onze enzymatische en cellulaire testen om hun inhibitorische potentie te evalueren. Verschillende moleculen bleken een uitgesproken inhibitie te veroorzaken in PA-enzymatische experimenten (IC50-waarden < 10 μM), met beloftevolle activiteit in celcultuur en gunstige selectiviteit. Echter, hoewel ze geconcipieerd waren als PAIs, was het antivirale doelwit in celcultuur van de meeste inhibitoren niet gerelateerd aan PA, maar eerder geassocieerd met een vroeg of laat stadium in de virale levenscyclus. We begonnen met het verder ontrafelen van hun werkingsmechanisme met behulp van ‘time-of-addition’ studies en confocale microscopie, en identificeerden minstens één molecule dat hoogstwaarschijnlijk de virale replicatie blokkeert door te interfereren met de PA-endonuclease-activiteit.

Met dit project hebben we een belangrijke bijdrage geleverd aan de ontwikkeling en optimalisatie van potentiële PAIs, en unieke inzichten verworven betreffende de precieze conformatie en metaalafhankelijkheid van het PA-enzym. Daarenboven hebben we tekortkomingen van de huidige enzymatische testen onthuld en overtuigend aangetoond dat vroege evaluatie van potentiële PAIs in relevante mechanistische experimenten gebaseerd op celcultuur, een essentieel onderdeel vormt van een succesvol ontwikkelingsproces.