Het effect van bacteriële oorlogsvoering op resistentie in Salmonella. Naar een meer optimale selectie van Levende Microbiële Formulaties.

De snelle toename van antibioticaresistentie brengt ons vermogen om bacteriële infecties op efficiënte wijze onder controle te krijgen in gevaar. Er is een dringende nood aan alternatieve behandelingen om het gebruik van antibiotica te vervangen of te complementeren. Probiotica staan daarbij toenemend in de belangstelling, met name vanwege hun veelzijdige mechanismen om pathogenen te bestrijden. Ondanks hun potentieel en lange gebruiksgeschiedenis, is de manier waarop ze interageren met pathogenen vaak niet goed gekarakteriseerd. Daarom is het begrijpen van deze sociale interacties van cruciaal belang om de behandeling met probiotica te optimaliseren. Gezien het toenemende gebruik van probiotica als alternatieve behandeling om antibioticaresistente pathogenen te bestrijden, is het belangrijk om hun werkzaamheid te bepalen tegen pathogenen die voordien resistentie ontwikkelden tegen klinisch gebruikte antibiotica. We stelden de hypothese dat mechanismen van antibioticaresistentie de werkzaamheid van probiotica kunnen beïnvloeden, en onderzochten daarom de precieze wisselwerking tussen probiotica en antibioticaresistente pathogenen. In dit werk verifiëren we aan de hand van in vitro experimenten of sommige interacties de werkzaamheid van probiotica kunnen verbeteren en ons zo mogelijks een voordeel kunnen bieden in de strijd tegen antibioticaresistentie.

In het eerste deel van dit onderzoek bekijken we of combinatorische behandeling met probiotica en antibiotica een veelbelovende risicospreidende strategie kan zijn wanneer de pathogeen een publiek resistentiemechanisme heeft. We onderzoeken of het publiek resistentiemechanisme bescherming kan bieden aan een probioticum tijdens een antibioticumbehandeling, waardoor het probioticum de pathogeen kan inhiberen wanneer het antibioticum op zichzelf daartoe niet in staat is. Hiertoe voeren we competitie-experimenten uit tussen β-lactamase-producerende Salmonella Typhimurium en antibioticum-gevoelige Escherichia coli Nissle onder behandeling met cefotaxime. We variëren factoren waarvan voorspeld werd dat ze de exploitatie van het gevoelige probioticum zouden beïnvloeden, zoals de antibioticumdosis, het tijdstip van behandeling en de inoculumdichtheid/frequentie. We tonen aan dat bescherming van het gevoelige probioticum optreedt onder veel van de geteste condities. Bescherming werd ook waargenomen voor een andere stam die Salmonella kan inhiberen, Bacillus subtilis PS216. Deze stam neemt een andere niche in dan Salmonella, wat de algemene geldigheid van onze bevindingen aangeeft en het sterk gedeelde karakter van het resistentiemechanisme onderstreept. Bovendien vinden we dat inhibitie door het probioticum gecorreleerd is met de graad van bescherming dat Salmonella tegen het antibioticum biedt. In de huidige klinische praktijk zijn combinatorische behandelingsopties beperkt vanwege het afsterven van het probioticum door het antibioticum. Ons werk benadrukt het toekomstige potentieel van combinatorische behandeling als een risicospreidende strategie om pathogenen te bestrijden die mogelijks drager zijn van een coöperatief resistentiemechanisme.

In het tweede deel van dit onderzoek bestuderen we of resistentie tegen klinische antibiotica de gevoeligheid voor bepaalde probiotica kan verhogen (= collaterale sensitiviteit) of verlagen (= kruisresistentie). Hiervoor wordt eerst een high-throughput flow cytometrie-gebaseerd experiment geoptimaliseerd welke de groei en efficiënte telling van een groot aantal coculturen toelaat bestaande uit Salmonella en probiotica. Hiertoe wordt een gepast groeimedium geselecteerd en wordt er gezocht naar een genomisch geïntegreerd fluorescent proteïne dat intens genoeg is om het onderscheid tussen Salmonella en probiotica toe te laten in flow cytometrie. Aangezien het Biofab:DsRed2 construct deze eigenschap bevat, wordt het in alle daaropvolgende experimenten gebruikt om Salmonella stammen te labelen. Vervolgens wordt het geoptimaliseerde flow cytometrie experiment gebruikt om een breed scala aan antibioticaresistente Salmonellae in competitie te plaatsen met acht probiotische stammen in de zoektocht naar combinaties waarbij Salmonella een verschil in fitness vertoont. Deze antibioticaresistente stammen zijn afkomstig van experimentele evolutie met antibiotica of zijn plasmide-gecodeerd. Binnen onze dataset worden geen sterke aanwijzingen gevonden voor kruisresistentie, terwijl er veel gevallen van collaterale sensitiviteit voorkomen. De aanwezigheid van bepaalde resistentiemechanismen verlaagt de fitness van Salmonella aanzienlijk in competitie met bepaalde probiotica, en leidt in sommige gevallen tot een snellere afname van Salmonella wanneer deze meerdere dagen in competitie gezet werd met probtioica. Bovendien bleek afwijkende groei in monospecies condities niet gecorreleerd met een verminderde fitness in competitie met probiotica. Deze bevindingen suggereren dat specifieke resistentiemechanismen de gevoeligheid voor probiotica rechtstreeks beïnvloeden. De analyse van de genoomsequenties laat een lage mutatielast zien voor de meeste stammen en maakt het mogelijk om voorlopige hypotheses te formuleren over onderliggende mechanismen, welke verder onderzocht kunnen worden in toekomstig werk.

Onze onderzoeksinspanningen benadrukken het potentieel van probiotica om antibioticaresistente pathogenen te bestrijden, aangezien twee verschillende scenario's werden onderzocht waarin de potentiële voordelen werden aangetoond van het gebruik van probiotica als een alternatieve of complementerende behandeling voor antibiotica. Een beter begrip van de onderliggende mechanismen is echter noodzakelijk om de rationele selectie van probiotische stammen te verbeteren met als doel om hun werkzaamheid tegen antibioticaresistente pathogenen te optimaliseren. Daarnaast zal de overgang naar in vivo experimenten van groot belang zijn om de klinische relevantie van onze bevindingen te beoordelen en deze te vertalen naar concrete probiotische behandelingsschema's in de toekomst.