Gentherapie voor mucoviscidose op basis van adeno-geassocieerde virale vectoren in een muismodel

Mucoviscidose is de meest voorkomende monogenetische levensbedreigende aandoening in de Caucasische populatie die veroorzaakt wordt door mutaties in CFTR, een chloride/bicarbonaat kanaal dat vloeistof transport regelt over epithelia in verschillende organen (luchtwegen, pancreas, darmen, zweetklier en vas deferens). Mucoviscidose is een multi-orgaan ziekte met longpathologie als voornaamste manifestatie. Mutaties in CFTR leiden tot een imbalans in ionen en water transport gevolgd door de productie van visceuze mucus dat het epitheel bedekt in de longen en bijdraagt tot een viscieuze circel van obstructie, herhaaldelijke infectie en inflammatie en uiteindelijk een irreversibele daling in longfunctie. Voor de meerderheid van de muco patiënten is er geen behandeling voorhanden die de oorzaak aanpakt en worden enkel de symptomen aangepakt.

Gentherapie geeft de mogelijkheid om een brede waaier aan genetische en verworven aandoeningen te behandelen. Recent is er een enorme vooruitgang geboekt in gentherapie gebaseerd op rAAV vectoren, waarbij een gentherapie product zelfs door de European Medicines Agency toelating heeft gekregen op de markt gebracht te worden. Deze resultaten hebben ons overtuigd om rAAV opnieuw te onderzoeken als mogelijke gentherapie strategie voor mucoviscidose. Daarnaast wint het belang van een vroege interventie in het gentherapie onderzoeksdomein aangezien verschillende studies een beter klinisch resultaat hebben kunnen aantonen na een vroege start van de behandeling. In dat opzicht zou neonatale gentherapie, uitgevoerd vooraleer er orgaanschade optreedt, het ontstaan van het ziektebeeld kunnen verhinderen.

Tegelijk met immuundeficiëntie aandoeningen, was mucoviscidose in de jaren ’90 een van de eerste ziektes om onderzocht te worden als mogelijke kandidaat voor gentherapie. Sindsdien zijn meer dan 20 klinische studies uitgevoerd voor mucoviscidose gentherapie, waarvan geen enkel resulteerde in een aanhoudende klinische verbetering. De onderzoeksvraag nu is hoe gentransfer naar de longen kan verbeterd worden. In dat perspectief is de doelstelling van mijn onderzoeksthesis hoe we een goed preklinisch diermodel kunnen ontwikkelen voor virale vector-gebaseerde gentherapie als eerste stap in de ontwikkeling van een gentherapie product voor mucoviscidose longpathologie.

In het eerste deel van mijn thesis heb ik een gentherapie strategie voor longziektes op basis van rAAV-vectoren ontwikkeld en gekarakteriseerd in de foetale, neonatale en adulte muis om zo generische vragen te beantwoorden zoals efficiëntie en stabiliteit van genexpressie. Door niet-invasieve bioluminescente beeldvorming en histologische analyse te combineren, kon ik efficiënte transductie aantonen in zowel de hogere als lagere luchtwegen (neus en longen, respectievelijk). Om een erfelijke ziekte zoals mucoviscidose te kunnen genezen door gentherapie, is levenslange genexpressie van het therapeutische gen noodzakelijk.

rAAV2/5-gemedieerde gentransfer in foetale en neonatale muizenluchtwegen, gevolgd door een readministratie in het adulte dier, resulteerde in persistente genexpressie tot 7 maanden, zonder een duidelijke daling. Bovendien kon ik aantonen dat een enkele dosis van rAAV2/5 toegediend in volwassen muizen aanleiding gaf tot genexpressie in de luchtwegen tot 15 maanden, wat bijna overeenkomt met de levensduur van een muis (1.5-2 jaar). Deze generische strategie toont het klinische potentieel aan van rAAV2/5 om erfelijke en verworven longaandoeningen te kunnen behandelen gedurende lange termijn, hetgeen nodig is om een permanente correctie van het ziektebeeld te kunnen bekomen.

In het laatste deel van mijn thesis heb ik de generische strategie gebaseerd op rAAV2/5 vector technologie vertaald naar een gentherapie model voor mucoviscidose. In vergelijking met de vroegere niet-succesvolle klinische studies op basis van rAAV vectoren, hebben wij een verbeterde rAAV vector ontwikkeld gebaseerd op een AAV serotype met luchtweg tropisme (rAAV2/5) en een getrunceerd maar functioneel minigen, CFTRΔR, waardoor incorporatie van een externe promoter voor optimale genexpressie mogelijk was. Op basis van verschillende functionele testen (iodide efflux assay, patch-clamp en forskolin-geïnduceerde zwellings-assay in organoïden) konden we aantonen dat CFTRΔR, met een deletie in het regulatoire domein, ion kanaal activiteit behoudt en gereguleerd wordt door cAMP/PKA in getransduceerde cellen. In een laatste stap heb ik het therapeutische potentieel van rAAV-CFTRΔR onderzocht in twee complementaire modellen: darmorganoïden afkomstig van mucopatiënten en in vivo in het neusepitheel van mucomuizen homozygoot voor de ΔF508 mutatie.