Geneesmiddel-geïnduceerde cholestase: in vitro detectie en mechanistisch inzicht.

Geneesmiddel-geïnduceerde leverschade (drug-induced liver injury, (DILI)) is één van de belangrijkste oorzaken van het stopzetten van klinische studies en/of het terugtrekken van geneesmiddelen, wat tot grote verliezen leidt voor farmaceutische bedrijven. Ondanks de enorme financiële verliezen ten gevolge van DILI, is de impact op de patiëntenzorg van veel groter belang. Zo zijn er in de literatuur tal van gevallen gerapporteerd die de potentieel fatale gevolgen van DILI illustreren. Er is dan ook een grote nood aan gevalideerde preklinische methodes voor de detectie van levertoxische moleculen tijdens de vroege fasen van het geneesmiddelenontwikkelingsproces. De complexiteit van DILI mechanismen bemoeilijkt echter de zoektocht naar deze gevalideerde methodes. Zo manifesteert DILI zich in een aantal predominante vormen waaronder cholestase, acute hepatitis en steatose, waardoor er tal van mechanismen aan de basis kunnen liggen van DILI. Een beter begrip van deze onderliggende mechanismen is dan ook een absolute prioriteit voor de verdere verfijning van preklinische selectiemethodes tijdens het geneesmiddelenonderzoek. Gedurende het laatste decennium werd dan ook veel moeite gedaan om de mechanismen van DILI te achterhalen. Zo blijkt ongeveer de helft van de DILI gevallen symptomen van cholestase te vertonen. Dit maakt van cholestase de belangrijkste oorzaak van DILI. Cholestase is een aandoening waarbij de galsecretie door de lever sterk is afgenomen, onder meer door inhibitie van de in de lever aanwezige transportmechanismen. Dit fenomeen resulteert in een pathologische accumulatie van galzouten, met levertoxiciteit tot gevolg. De vroegtijdige detectie van geneesmiddel-geïnduceerde cholestase (drug-induced cholestasis (DIC)) blijft echter een grote uitdaging tijdens de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. De meest courante in vitro modellen veronderstellen dat het nagaan van de interactie met één of meerdere hepatische transporteiwitten voldoende is om het in vivo cholestatisch potentieel van een molecule te bepalen. Dit is echter een veel te eenvoudige voorstelling. Deze modellen beperken DIC immers tot de interferentie met één of meerdere hepatische transporteiwitten, terwijl galzouthomeostase in werkelijkheid een uitgebreider netwerk aan processen omvat. Deze tekortkoming kan verholpen worden door gebruik te maken van meer in vivo-relevante in vitro modellen, zoals humane hepatocyten in sandwich-cultuur (sandwich-cultured human hepatocytes, SCHH). Onze onderzoeksgroep heeft gedurende de voorbije jaren een op SCHH gebaseerd in vitro model ontwikkeld. Dit model is in staat om cholestase-inducerende moleculen te identificeren. Hoewel de methode cholestatische moleculen kan onderscheiden van levertoxische maar niet-cholestatische en niet-levertoxische verbindingen, kan aan de hand van deze methode geen mechanistisch inzicht verworven worden in wijzigingen in galzouthomeostase. Dergelijke informatie is zeer waardevol, zeker wanneer men een geïnformeerde beslissing over het cholestatisch potentieel van een nieuw geneesmiddel dient te maken. Het overkoepelende doel van dit proefschrift is dan ook om relevante in vitro galzoutdispositie- data te genereren en deze te analyseren, gebruik makende van zowel standaard niet-compartimentele analysetechnieken als een meer geavanceerd cellulair mechanistisch dispositiemodel. Dit moet toelaten een beter inzicht te verkrijgen in DIC. De in vitro gegevens werden verkregen door middel van een verbeterde experimentele opstelling die bestond uit het incuberen van de prototypische galzouten chenodeoxycholzuur (CDCA) en diens conjugaat glycochenodeoxycholzuur (GCDCA) in aan- en afwezigheid van therapeutisch relevante bosentan-concentraties.

Daar gecryopreserveerde humane levercellen (hepatocyten) in dit proefschrift werden gebruikt, werd in een eerste studie nagegaan of gecryopreserveerde levercellen een betrouwbaar alternatief zijn voor vers- geïsoleerde cellen. De resultaten van dit onderzoek toonden duidelijk aan dat cryopreservatie geen noemenswaardig effect had op de biochemische integriteit of het in vitro toepassingspotentieel van de cellen. Bovendien toonden transporterstudies aan dat de activiteit van de organic anion transporting polypeptide (OATP) en de multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2) ongewijzigd bleef na cryopreservatie. In dezelfde studie werd de dispositie van telmisartan en telmisartan-glucuronide geëvalueerd door middel van een cellulair mechanistisch dispositiemodel. Hierdoor konden we nagaan of specifieke dispositieroutes veranderden na cryopreservatie. Het model voorspelde dat de relatieve bijdrage van opname, metabolisme en efflux van telmisartan en telmisartan-glucuronide ongewijzigd bleef na cryopreservatie. Dit geeft aan dat gecryopreserveerde levercellen een geschikt alternatief zijn voor vers-geïsoleerde cellen. Naast het bepalen van de effecten van cryopreservatie op de functionaliteit van hepatocyten, werd in deze studie ook een generiek mathematisch raamwerk ontwikkeld dat gebruikt kon worden in toekomstige studies. In een tweede studie werd dit raamwerk gebruikt om een mechanistisch dispositiemodel te ontwikkelen dat in staat was om de effecten van bosentan op de dispositie van CDCA en GCDCA kwantitatief te bepalen. Het model bestond uit zeven compartimenten waarnaar CDCA en GCDCA zich konden verdelen met behulp van zowel lineaire als niet-lineaire kinetiek. Het model voorspelde dat de conjugatie van CDCA evenals de canaliculaire secretie van GCDCA afnam in aanwezigheid van bosentan. Deze bevindingen waren bovendien in overeenstemming met de niet-compartimentele analyseresultaten en rapporten van andere onderzoeksgroepen. Tijdens deze studie werd de galzoutdispositie echter niet in alle geteste donoren beïnvloed door bosentan. Dit toont het belang aan van het gebruik van in vivo-relevante in vitro modellen bij de beoordeling van DIC. Soortgelijke waarnemingen werden gemaakt in een laatste studie. Hier wilden we nieuwe inzichten verwerven in de rol van Ro 47-8634 (O-demethylatie van bosentan), Ro 48-5033 (hydroxylatie van bosentan) and Ro 64-1056 (combinatie of hydroxylatie and O-demethylatie van bosentan), de drie fase I metabolieten van bosentan, in de totale toxische respons van bosentan. Ook hier werd de dispositie van CDCA en GCDCA in aanwezigheid van bosentan geëvalueerd met behulp van SCHH die afkomstig waren van drie donoren met verschillende metabole capaciteiten. Zoals verwacht vormde de donor met de grootste metabole capaciteit de grootste hoeveelheid metabolieten. Dit was echter ook de enige donor die een significante afname vertoonde in de opname van CDCA en daaropvolgende conjugatie naar GCDCA na behandeling met bosentan, wat suggereerde dat de vorming van Ro 47-8634, Ro 48-5033 en/of Ro 64-1056 aan de basis zou kunnen liggen van de waargenomen effecten. Regressie analyse toonde aan dat de afname in de opname van CDCA, althans gedeeltelijk, kon worden toegeschreven aan de vorming van Ro 47-8634, Ro 48-5033 en/of Ro 64-1056, terwijl de afname in de conjugatie van CDCA hoogstwaarschijnlijk het gevolg was van directe interactie met bosentan.

Door gebruik te maken van een verbeterde experimentele opstelling die bestond uit het incuberen van SCHH met CDCA in aan- en afwezigheid van therapeutisch relevante bosentan concentraties, gaf dit proefschrift nieuwe inzichten in DIC. Door subtiele wijzigingen in de dispositie van CDCA en GCDCA te kwantificeren met behulp van niet-compartimentele analysetechnieken en een cellulair mechanistisch dispositiemodel, werden nieuwe inzichten verworven in het samenspel van de toxiciteitsmechanismen van bosentan. Zo bleek dat de vorming van Ro 47-8634, Ro 48-5033 en Ro 64-1056 potentieel een rol speelt in de geobserveerde wijziging in galzoutopname, terwijl dat de afname in de verdere conjugatie van niet-geconjugeerde galzouten naar diens geconjugeerde vorm hoogstwaarschijnlijk het gevolg zijn van interferentie door bosentan.