Geneesmiddel-geïnduceerde cholestase: Een mechanistische exploratie van de hepatische galzout dispositie

Geneesmiddel-geïnduceerde levertoxiciteit (Drug-induced liver injury, DILI) is de meest voorkomende reden voor het van de markt halen van geneesmiddelen (Xu et al., 2004; Atienzar et al., 2016). Het vormt als dusdanig een groot risico voor de gezondheid van de patiënt, maar ook voor de farmaceutische industrie. Gedurende niet-klinische toxiciteitsonderzoeken is er een gebrek aan de identificatie van geneesmiddelen die DILI kunnen veroorzaken, hetgeen ernstige problemen vormt voor de farmaceutische industrie. De huidige niet-klinische in vivo dierproeven kunnen DILI niet betrouwbaar detecteren aangezien verscheidene DILI mechanismen verschillen tussen dieren en mens. Bijgevolg en daarbij ook rekening houdend met het 3R principe (replacement, refinement, reduction), heeft het niet-klinisch toxiciteitsonderzoek als doel de conventionele in vivo dierproeven te vervangen en betrouwbare in vitro methoden te implementeren. Deze in vitro methoden zijn cruciaal voor de nauwkeurige voorspelling en screening van geneesmiddelen die DILI kunnen veroorzaken. Helaas is de zoektocht naar de ontwikkeling van zulke nieuwe modellen of de optimalisatie van de huidige in vitro modellen ook nog steeds belemmerd door de beperkte mechanistische kennis met betrekking tot DILI. Daarom is het cruciaal om ons begrip over de toxiciteitsmechanismen van DILI te vergroten en om als dusdanig onze kennis over DILI te verbeteren.

Eén van de belangrijkste vormen die betrekking heeft tot DILI is geneesmiddel-geïnduceerde cholestase (Drug-induced cholestasis, DIC). DIC maakt meer bepaald deel uit van ongeveer de helft van de DILI cases uit. DIC wordt veroorzaakt door een storing in de galzout homeostase, wat resulteert in een pathologische accumulatie van galzouten in de lever die uiteindelijk leverschade teweeg brengen. Daarom is het belangrijk dat de pathways die verantwoordelijk zijn voor het behoud van de galzout homeostase in vivo, worden nagebootst in een in vitro model. Tot nu toe werd de inhibitie van de Bile Salt Export Pump (BSEP) aangenomen het enige mechanisme te zijn met betrekking tot DIC. Aangezien de galzout homeostase een complexe wisselwerking vormt tussen verscheidene andere hepatische transport proteïnes en metaboliserende enzymes, groeit het belang van een meer uitgebreide mechanistische kennis over andere oorzaken van DIC, afgezien van BSEP inhibitie. Bovendien zal een verbeterde kennis over de verschillende aspecten van de galzout homeostase onze perceptie verruimen voor de ontwikkeling van meer geavanceerde in vitro en in silico modellen.

Het overkoepelende doel van het huidige proefschrift was gericht op het mechanistisch begrijpen van interferenties in de galzout homeostase, veroorzaakt door geneesmiddelen. Derhalve werden levercellen van rat of humane oorsprong in een sandwich-configuratie (tussen twee lagen collageen; SCRH of SCHH) aangewend als in vitro model om de galzout dispositie in vitro na te bootsen. Dit model bevat alle lever-specifieke functies, samen met het behoud van hepatische transport proteïnes en metabolische enzymes. In dit opzicht werd een door onze onderzoeksgroep eerder ontwikkeld in vitro DIC systeem geoptimaliseerd en gevalideerd met behulp van een bredere set aan (niet)-lever toxische componenten (Doelstelling 1). Dit in vitro DIC systeem is gebaseerd op de incubatie van een cholestatische component met een fysiologisch galzout mengsel, teneinde de vorming van ureum te meten om zo de cel functionaliteit te bepalen. In een volgende fase werd dit in vitro DIC systeem geïmplementeerd om als mechanistisch platform te dienen zodanig de huidige kennis over de rol van andere hepatische transport proteïnes in DIC te verbeteren (Doelstelling 2). Het onderzoek in huidig proefschrift heeft getracht een antwoord te geven op specifieke onderzoeksvragen:

Kunnen zowel gecryopreserveerde als vers-geïsoleerde cellen worden gebruik in het in vitro DIC systeem? (Hoofdstuk 3; onderdeel van Doelstelling 1)

Kunnen cholestatische verbindingen op betrouwbare wijze voorspeld en vertaald worden naar een risico voor DIC in vivo, gebruikmakende van het in vitro DIC systeem? (Hoofdstuk 4; onderdeel van Doelstelling 1)

Welke mechanismen zijn betrokken bij de stimulatie van OATP1B1-gemedieerde opname in hepatocyten en speelt dit mechanisme een rol in de onderbreking van de galzout homeostase, veroorzaakt door een geneesmiddel? (Hoofdstuk 5 en 6; Deel van doelstelling 2)

Hoe kan bosetan de galzout dispositie beïnvloeden, zoals weerspiegeld met een prototypisch galzuur, chenodeoxycholzuur (CDCA), in SCHH en welke mechanismen zijn hierbij betrokken? (Hoofdstuk 7, onderdeel van Doelstelling 2)

Een eerste studie demonstreerde de uitwisselbaarheid van hepatocyten vóór of na cryopreservatie in het in vitro DIC systeem. Hiervoor hadden we gebruik gemaakt van SCRH, hetgeen een adequate robuustheid bleek te bieden. Tijdens de studie werden SCRH, verkregen uit ofwel vers-geïsoleerde als cryopreserveerde hepatocyten, gebruikt om het cholestatische potentieel van twee gekende cholestatische verbindingen, cyclosporin A en troglitazone te bepalen. Het onderzoek leverde soortgelijke geneesmiddel-geïnduceerde cholestase index waardes (drug-induced cholestasis index; DICI) op, onafhankelijk van de cryopreservatie geschiedenis. Een DICI waarde weerspiegelt de verhouding van ureum dat is geproduceerd onder de omstandigheden waarbij de componenten met een mengsel van galzouten samen geïncubeerd werden en het ureum geproduceerd onder omstandigheden waarin de componenten alleen werden geïncubeerd. Een DICI waarde lager dan 0.80 suggereert dat een component bij een bepaalde concentratie de galzout homeostase in de SCRH kan verstoren. Het was belangrijk dat we tijdens de huidige studie de ureumproductie voor de confluentie van de culturen normaliseerden, aangezien SCRH van cryopreserveerde hepatocyten een lagere confluentie bleken te hebben, in vergelijking met SCRH van vers-geïsoleerde hepatocyten.

Om de tweede onderzoeksvraag te beantwoorden, werden 14 (niet)-levertoxische componenten van het EU-EFPIA IMI-project MIP-DILI consortium gebruikt om de prestaties van het in vitro DIC systeem te onderzoeken en aldus een meer uitgebreide validatie van het model uit te voeren. Verscheidene batches van humane hepatocyten in sandwich-cultuur waren gekwalificeerd met betrekking tot hun gevoeligheid voor de analyse van DIC in vitro door cyclosporin A-geïnduceerde veranderingen in de galzout homeostase na te gaan. Om de hoge inter-individuele variabiliteiten tussen donoren te verduidelijken, werden "Cyclosporin A DICI-positieve" humane donoren geïntroduceerd om humane donoren uit te sluiten die geen storing in de galzout homeostase veroorzaakten in aanwezigheid van cyclosporin A. De 14 (niet)-levertoxische componenten werden ingedeeld op basis van het veiligheidsmarge (Safety Margin; SM) -concept. Met behulp van de SM, kunnen we het cholestatisch risico van elke component in vivo bepalen. In de huidige studie was het mogelijk om alle 14 (niet)-levertoxische componenten eenduidig te classificeren op hun risico op DIC in vivo, gebaseerd op de SM en in vivo incidentie zoals in de literatuur vermeld stond.

De volgende twee studies richtten zich op het mechanistische begrip van de door geneesmiddelen-geïnduceerde verstoringen van de galzout homeostase. Daarom werd de rol van hepatische opname, namelijk het Organische Anion Transporting Polypeptide 1B1 (OATP1B1) in de galzout homeostase dieper bestudeerd. Als hypothese werd gesteld dat domperidone, waarvoor modulatie van OATP1B1-gemedieerd transport in vitro is aangetoond, de opname van galzouten zou kunnen stimuleren en als zodanig de galzout homeostase zou kunnen verstoren. Als eerste, hebben we het modulerende effect van domperidone op OATP1B1-gemedieerde opname van 2 fluorescerende substraten (natriumfluoresceïne en cGamF) onderzocht met behulp van verschillende hepatische in vitro modellen, namelijk OATP1B1-getransfecteerde cellijnen, rat en humane levercellen in suspensie. Daarnaast werd de rol van OATP onderzocht bij de opname van domperidone in hepatocyten van rat en menselijke oorsprong. In het algemeen werd aangetoond dat de stimulerende capaciteit van domperidone substraat- en isoform-afhankelijk was. Daarnaast resulteerde domperidone in een inhibitie van natriumfluoresceine transport in rat hepatocyten. Ten tweede werd het in vitro DIC systeem toegepast om het effect van domperidone op de galzout homeostase te onderzoeken. Opnieuw werd een species-afhankelijk effect waargenomen, waarbij werd aangetoond dat domperidone de galzout homeostase duidelijk in de humane hepatocyten verstoorde, hetgeen niet het geval was in rat hepatocyten. Naast verlaagde DICI waarden door domperidone in humane cellen, was domperidone in staat om de hoeveelheid van de glycine geconjugeerde galzouten te verlagen, terwijl verhogingen werden waargenomen in de hoeveelheid van niet-geconjugeerde galzouten op een concentratieafhankelijke wijze. Daardoor werd er een nieuwe parameter geïntroduceerd, namelijk de bile acid disturbance index (BADI), hetgeen mechanistische informatie bood in welke mate een (cholestatische) component de galzout homeostase kon verstoren in humane cellen. De BADI-waarde is een verhouding van het relatieve verschil in de accumulatie van niet-geconjugeerde galzouten in het cultuur medium en het relatieve verschil in de accumulatie van intracellulaire geconjugeerde galzouten. Zowel domperidone als de positieve controle cyclosporine A waren in staat om BADI op een vergelijkbare manier te verhogen, terwijl afname in DICI waarden voor beide componenten werd waargenomen. Verder werd er geobserveerd dat domperidone de hoeveelheden van endogene galzouten kon verlagen. De studie concludeerde dat domperidone en cyclosporine A in staat waren om de galzout homeostase te wijzigen door mechanismen die nog niet volledig zijn uitgelicht. De modulatie van galzout opname transport in humane hepatocyten zou echter een mogelijk mechanisme kunnen zijn dat deel uitmaakt van DIC. In het algemeen kunnen we stellen dat een betrouwbare meting van endogene en exogeen toegevoegde galzouten in het cultuur medium en cellen een interessant en gevoelig hulpmiddel zijn om veranderingen in de galzout homeostase te onderzoeken. Als conclusie werd er gesteld dat een verstoring in de galzout homeostase, in plaats van een intracellulaire accumulatie van galzouten in het bijzonder, dient als aanvang van DIC.

In een laatste studie van het proefschrift, werd er verondersteld dat andere mechanismen dan BSEP-inhibitie mogelijks betrokken zouden zijn bij bosentan-geïnduceerde cholestase. Daarom hebben we de effecten van klinisch relevante concentraties bosentan bestudeerd op de dispositie van endogene galzouten, maar ook werd het effect van bosentan nagegaan wanneer hepatocyten extra gechallenged werden met CDCA. Hierbij hebben we aangetoond dat bosentan in staat was de opname van CDCA te remmen, mogelijks de omzetting van CDCA naar GCDCA te inhiberen en beide sinusoidale en canaliculaire efflux klaringen te beïnvloeden. Bovendien werd inhibitie van galzout synthese door bosentan waargenomen door een verminderde hoeveelheid endogene galzouten in aanwezigheid van bosentan in SCHH. Ten slotte kregen we inzicht in het algemene effect van bosentan op de galzout homeostase in SCHH. In dat opzicht verschaffen deze resultaten een mechanistisch perspectief op de interferentie van bosentan op de galzout dispositie in humane hepatocyten, hetgeen ons zal helpen bij het bekomen van een verbeterd mechanistisch inzicht in bosentan-geïnduceerde cholestase.

Samengevat heeft dit onderzoek bijgedragen aan de ontwikkeling en verbetering van nieuwe en momenteel bestaande in vitro methoden voor een betere voorspelling van DIC in vivo. Het in vitro DIC systeem draagt bij tot een betere identificatie van geneesmiddelen of kandidaat-geneesmiddelen die mogelijks DIC in vivo veroorzaken en zodoende ondersteunt het systeem een adequate besluitvorming met betrekking tot het risico van DIC in vivo in te schatten. Daarnaast leverde het inzicht op in de mechanismen die betrokken zijn bij geneesmiddel-geïnduceerde veranderingen in de galzout homeostase door de impact van hepatische opname transport proteïnes in DIC na te gaan. Een verbreking van de galzout homeostase, in plaats van een intracellulaire accumulatie van galzouten is verondersteld aan de basis te liggen van galzout-gemedieerde toxiciteit, hetgeen blijkt uit de gevoelige analyse van galzouten in verschillende compartimenten (medium, cel en gal). Daarom, galzoutmetingen dienen als waardevolle eindpunten om de pathways in de galzout homeostase, die onderbroken worden door een cholestatische verbinding, mechanistisch te bepalen. Hoewel er nog veel fundamentele vragen open blijven, zullen de verkregen resultaten nuttig zijn bij de verdere ontwikkeling van andere, meer geavanceerde in vitro modellen om DIC te voorspellen en benadrukt dit onderzoek het belang om onze kennis te vergroten over de belangrijke pathways die een rol spelen bij DIC.