Garantie van de veiligheid van levende Salmonella vaccins door introductie van deleties in cruciale genen voor eibesmetting

Sinds 1990 is Salmonella enterica subspecies enterica serovar Enteritidis een pandemisch
pathogeen, aanwezig in landen met industriële pluimveeproductie. Inname van deze voedselgeassocieerde pathogeen door de mens veroorzaakt gastro-enteritis en wordt gelinkt aan besmette eieren en ei-producten. Salmonellose veroorzaakt door Salmonella enteritidis in kippen leidt
echter niet tot klinische symptomen maar zorgt voor zware economische verliezen. Zodoende is
er voortdurende interesse om mogelijke manieren te vinden om leghennen te beschermen tegen
infectie met Salmonella. De controle van deze Salmonella infecties in pluimveebedrijven begint
met een goed management en strikte veiligheidsmaatregelen. Bij leghennen is vaccinatie een zeer
belangrijke maatregel om besmetting te voorkomen. Vaccinatie tegen Salmonella Enteritidis
gebeurt wereldwijd. Studies rapporteren dat het aantal gevallen van humane salmonellose
significant gedaald is na het implementeren van vaccinatieprogrammaU+2019s in commerciële
leghennen. Hoewel er grote vorderingen gemaakt zijn, duiken er toch atypische pathogene
Salmonella stammen op. Bij het begin van dit doctoraat tonen studies uit verschillende landen het
snel opkomen van een monofasische variant van Salmonella Typhimurium, ie 4,12:i:- aan.
Humane salmonellose veroorzaakt door deze monofasische variant wordt gelinkt aan een aantal
oorzakelijke bronnen, voornamelijk varkens. Stammen van dit serotype worden ook
teruggevonden in vleeskippen en recentelijk ook in leghennen. Dit toont aan dat besmetting door
de monofasische variant een belangrijke bedreiging vormt voor mensen, niet enkel via
varkensvlees, maar ook via producten afkomstig van kippen. Bijgevolg werd deze stam
geïncludeerd in acties die de controle en detectie van Salmonella serovars, gevaarlijk voor de
volksgezondheid, omschrijven.
De werkzaamheid van de commerciële levende vaccines AviPro® Salmonella VacE en VacT
voor de bescherming van leghennen tegen oviduct kolonisatie door Salmonella Enteritidis werd
reeds beschreven, maar geen enkele data werden reeds gepubliceerd over het potentieel
beschermend effect van deze vaccins tegen de opkomende monofasische variant op gebied van
lever, milt en caecum kolonisatie. Daarom werden in een eerste studie van deze thesis twee korte-
termijn (2 weken), met een hoge en lage orale toediening van de monofasische variant, en 1
langere termijn studie (6 weken) opgezet om na te gaan of de Salmonella Typhimurium stam
Nal2/Rif9/Rtt, die aanwezig is in de commercieel beschikbare levende vaccins AviPro®
Salmonella Duo en AviPro® Salmonella VacT ook bescherming biedt tegen deze monofasische
variant (hoofdstuk 3.1). Orale toediening van het vaccin op dag 1 reduceerde de kolonisatie met
de monofasische Salmonella Typhimurium variant 4,12,:i:- na toediening ervan op dag twee. De
autochtone intestinale microbiota van eendagskuikens is nog niet volledig matuur en ook het
immuunsysteem is nog niet volledig ontwikkeld. Dit Salmonella 4,12,:i:- serotype is
Typhimurium-achtig en kan, zoals aangetoond in dit hoofdstuk, ook gebruikt worden voor
bescherming in de vroege levensfase door het gebruik van levende Salmonella Typhimurium
vaccins. Dit is van belang voor leghennen alsook voor vleeskippen en kan deel uitmaken van een
controleprogramma tegen de opkomende monofasische varianten.
Deze monofasische Salmonella Typhimurium 1,4,5,12,:i:- varianten ontbreken een fljBgecodeerde 2de fase antigen. Het ontbreken van deze flagellen zou de virulentiekarakteristieken
van Salmonella kunnen veranderen, maar de precieze rol van deze flagellen in de pathogenese
van Salmonella infecties bij de kip is niet volledig duidelijk. Er was slechts zeer weinig gekend
over de rol van flagelline tijdens oviduct kolonisatie. Flagelline interageert met pathogene
herkenningsreceptoren die aanwezig zijn op epitheelcellen van de oviduct bij leghennen. Binding
van flagelline met deze patronen leidt normaalgezien tot een sterke immuunrespons en met
ontsteking en weefselschade als gevolg. Salmonella Enteritidis is echter in staat om de oviduct te
koloniseren zonder een sterke immunologische reactie op te wekken. We hebben kunnen
aantonen dat de expressie van flagellen bij Salmonella Enteritidis neergereguleerd is na
kolonisatie van de oviduct, alsook in de epitheelcellen van de oviduct (hoofdstuk 3.2). De studies
in hoofdstuk 3.2 tonen aan dat Salmonella Enteritidis in staat is om een effectieve
immuunrespons van de gastheer te vermijden terwijl hij de oviduct koloniseert door het down
reguleren van flagelline expressie. Verdere studies zijn nodig om de signaalmechanismen te
identificeren die betrokken zijn in deze downregulatie van flagel door Salmonella Enteritidis in
de omgeving van de oviduct. Deze informatie kan van belang zijn voor toekomstig vaccin
onderzoek.
De huidige commerciële levende vaccins bevatten stammen die ongedefinieerde mutaties
bevatten in 1 of meerdere genen op het chromosoom. Stammen met dit soort mutaties zouden
echter kunnen terugkeren naar een virulent fenotype en worden dus beschouwd als onveilig.
Toekomstige levende vaccins zouden dus volledig gedefinieerde stammen moeten bevatten die
enkele of meerdere, volledige genen ontbreken. De meeste experimentele vaccins bevatten
stammen die genen ontbreken die belangrijk voor het metabolisme of virulentie. Verschillende
experimentele vaccins werd reeds getest in een aantal diersoorten, waaronder kippen, maar data
over de bescherming van levende vaccins tegen ei besmetting zijn zeer zeldzaam. Een vaccin
stam dat wordt gebruik voor de bescherming van verticale ei besmetting door Salmonella
Enteritidis induceert idealiter een lokale immuunrespons in de reproductieve tractus. Vanuit het
oogpunt van de volksgezondheid, mag het niet persisteren en bij voorkeur niet overleven in eiwit.
Een logische aanpak is dus om genen te elimineren die belangrijk zijn voor eiwitoverleving. In
het derde hoofdstuk (hoofdstuk 3) worden gedefinieerde mutanten voor MDR transporters
gebruikt als vaccin stammen. Het tolc buitenste membraankanaal wordt gebruikt door MDR
transporters (zoals acrAB, acrF en mdtABC) om antibacteriële componenten en bacteriële
molecules te exporteren en is betrokken in de overleving in eiwit. De Salmonella Enteritidis U+0394tolC
en U+0394acrABacrEFmdtABC stammen kunnen niet langer overleven in eiwit, hierbij wordt het risico
op humane contaminatie door de vaccin stam via eieren geëlimineerd. De vaccin stammen waren
in staat om ei besmetting met Salmonella te vermijden in een 6 maand in vivo proef.
Samengevat, verschillende maatregelen werden gebruikt om Salmonella infecties in de pluimvee
industrie te controleren en te vermijden. Ondanks deze maatregelen duiken nieuwe
(monofasische) varianten op. De huidige commerciële vaccins bieden bescherming tegen deze
opkomende (monofasische) varianten. Het is belangrijk om continu te evalueren als de huidige
vaccins bescherming bieden tegen nieuwe, opkomende varianten om zo snel mogelijk in te
kunnen spelen op eventuele epidemiologische veranderingen. Tegelijkertijd is het belangrijk om
de veiligheid van vaccinstammen te garanderen door het verwijderen van (een) volledig(e)
gen(en). De Salmonella Enteritidis U+2206tolC and U+2206acrABacrEFmdtABC vaccin stammen zijn veilige
stammen die zouden kunnen gebruikt worden om ei besmetting te voorkomen.