< Terug naar vorige pagina
Project
Fysiologische en genetische responsen van de polycyclische aromatische koolwaterstof afbrekende Sphingomonas sp. LH128 naar abiotische stress
Polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAHs) zijn wijdverspreide organische polluenten in het milieu die gekend zijn voor hun toxische, kankerverwekkende en mutagene eigenschappen. PAH degraderende micro-organismen kunnen ingezet worden in de bioremediatie van PAH vervuilde bodems,maar de polluent afbraak gebeurt niet altijd efficiënt. Dit kan te wijten zijn aan verscheidene (a)biotische stresscondities die in bodem kunnen voorkomen. Het doel van deze studie was om de responskenmerken en genfuncties te identificeren die betrokken zijn bij de mitigatie van stress situaties in bodem in de fenantreen-degraderende Sphingomonas</> sp. LH128 als reactie op abiotische stress. In een eerste deel lag de focus op het identificeren van de fysiologische en transcriptionele respons van LH128 cellen in biofilms wanneer deze werden blootgesteld aan ofwel een acute (4 h) of een chronische (3 dagen) zoutstress (450 mM NaCl) en dit in relatie met de fenantreen-afbraakactiviteit van de biofilm. Biofilm morfologie, zuurstofconsumptie en fenantreenmineralisatie werden niet significant beïnvloed door noch de acute noch de chronische zoutstress. Dit was overeenkomstig de transcriptiedata, sinds er geen verschil was tussen de expressie van PAH-katabole genen onder stress- en niet-stresscondities. Er kon besloten worden dat LH128 zijn PAH katabole activiteit behoud bij zoutstress en zich snel aanpast door een toename in de mate van verzadiging van membraanvetzuren en door een verhoogde expressie van genen betrokken bij zoutstress zoals osmoregulatorische genen.
In een tweede deel van dit onderzoek werd plasposonmutagenese gebruikt voor het identificeren van genen betrokken bij het overleven en de activiteit van LH128 bij zout- en matrixstress waarvoor een mutanten bibliotheek van 5000 mutanten werd aangemaakt. Elf en 14 mutanten bleken een beperkte groei te vertonen wanneer blootgesteld aan respectievelijk zoutstress (450 mM NaCl) en matrixstress (10% w/vPEG6000). De geïdentificeerde verstoorde genen in de mutanten gelimiteerd in groei bij NaCl stress waren steeds verschillend van deze geïdentificeerd in de mutanten gelimiteerd in groei bij matrix stress. Een door NaCl-beïnvloedde mutant (NA7E1) bevatte de insertie in een gen coderend voor een membraanproteïne (OpsA) en werd reeds bij lagere NaCl-concentraties gelimiteerd in groei in vergelijking met andere mutanten. NA7E1 was tevens de enige mutant die een reductie in groei en fenantreenafbraak vertoonde in bodem. Er werd besloten dat opsA</> een cruciaal gen is in de overleving van LH128 in bodem en meer bepaald bij bodems met een gereduceerd vochtgehalte door mitigatie van zoutstress.
De fysiologische respons en katabole activiteit met betrekking tot fenantreen afbraak van stam LH128 wanneer geïnoculeerd in met fenantreen verontreinigde grond, werd vervolgens in detail onderzocht. Vier uur na inoculatie vertoonde LH128 een snelle en sterke reductie (tot 100 voudig) in het aantal kolonievormende eenheden (CVE) waarna deze weer steeg naar een niveau als op het moment van inoculatie. WanneerGfp-gelabelde LH128 cellen microscopisch werden geteld werd echter geen verschil gevonden tussen de celdensiteit op het moment van inoculatie en deze na 4 uur incubatie in de bodem. Dit suggereert dat de LH128 cellen levend zijn maar in een toestand verkeren dat ze niet cultiveerbaar zijn (Viable But None-culturable Cells (VNBC)). De VNBC-achtigecellen leken niet in een dormante toestand te verkeren maar vertoonden een zekere activiteit als bleek uit de graad van verzadiging van membraanvetzuren. Bovendien vertoonden deze cellen een hoge PAH-afbraakactiviteit zoals gesuggereerd door modellering en transcriptoomanalyse. Deze laatste gaf een sterk verhoogde expressie van genen (tot 133-voudig) weer die betrokken zijn in PAH-afbraak na inoculatie en tevens van genen betrokken bij stressrespons. Dit geeft aan dat een substantieel deel van de cellen stress ondervonden in de bodem.
Een gelijkaardige methodiek werd gehanteerd voor de fysiologische en transcriptionele respons van LH128op een gebrek aan nutriënten. LH128 past zich aan de starvatie door celgrootte te verminderen, celvorm te veranderen en de graad van verzadiging van membraanvetzuren te verhogen. Bijkomend werd een verhoogde expressie van genen coderend voor effluxsystemen of betrokken bij het aanwendenvan opgeslagen reserves waaronder rRNA en vetzuren waargenomen, alsook een verlaagde expressie van genen coderend voor biosynthese van ribosomale proteïnen, chromosomale replicatie en celdeling.
In een laatste deel werd een wholecell bioreporter geconstrueerd in LH128 door een transcriptionele fusie van de promotor regio van phnA1f</> met gfp</>en dit ter detectie van PAH-biodegradatieactiviteit en de biobeschikbare fractie van PAHs in de bodem. Deze ontwikkelde reporterstam, LH128PGFP, liet toe PAHs aanwezig in vloeibare culturen en in met PAH verontreinigde bodems zowel op agar als in microcosmos te detecteren. Deze snelle en eenvoudige bioreportergebaseerde diagnostiek benadering ter detectie van biobeschikbare PAHs kan een interessant gereedschap zijn voor beleidsmakers bij het monitoren van bioremediatieactiviteiten en de efficiëntie ervan.
We kunnen algemeen besluiten dat Sphingomonas</> sp. LH128 verschillende kenmerken vertoont van adaptatie aan abiotische stress zonder een verlies van PAH-afbraakactiviteit. De combinatie van het behoud van activiteit en een snelle adaptatie aan stresscondities maakt dat LH128 en mogelijk ook andere Sphingomonas</> stammen kunnen bijdragen aan biodegradatie van polluenten of als whole cell biosensor toepassingen in gecontamineerde milieus die regelmatig aan abiotischestress worden blootgesteld.
In een tweede deel van dit onderzoek werd plasposonmutagenese gebruikt voor het identificeren van genen betrokken bij het overleven en de activiteit van LH128 bij zout- en matrixstress waarvoor een mutanten bibliotheek van 5000 mutanten werd aangemaakt. Elf en 14 mutanten bleken een beperkte groei te vertonen wanneer blootgesteld aan respectievelijk zoutstress (450 mM NaCl) en matrixstress (10% w/vPEG6000). De geïdentificeerde verstoorde genen in de mutanten gelimiteerd in groei bij NaCl stress waren steeds verschillend van deze geïdentificeerd in de mutanten gelimiteerd in groei bij matrix stress. Een door NaCl-beïnvloedde mutant (NA7E1) bevatte de insertie in een gen coderend voor een membraanproteïne (OpsA) en werd reeds bij lagere NaCl-concentraties gelimiteerd in groei in vergelijking met andere mutanten. NA7E1 was tevens de enige mutant die een reductie in groei en fenantreenafbraak vertoonde in bodem. Er werd besloten dat opsA</> een cruciaal gen is in de overleving van LH128 in bodem en meer bepaald bij bodems met een gereduceerd vochtgehalte door mitigatie van zoutstress.
De fysiologische respons en katabole activiteit met betrekking tot fenantreen afbraak van stam LH128 wanneer geïnoculeerd in met fenantreen verontreinigde grond, werd vervolgens in detail onderzocht. Vier uur na inoculatie vertoonde LH128 een snelle en sterke reductie (tot 100 voudig) in het aantal kolonievormende eenheden (CVE) waarna deze weer steeg naar een niveau als op het moment van inoculatie. WanneerGfp-gelabelde LH128 cellen microscopisch werden geteld werd echter geen verschil gevonden tussen de celdensiteit op het moment van inoculatie en deze na 4 uur incubatie in de bodem. Dit suggereert dat de LH128 cellen levend zijn maar in een toestand verkeren dat ze niet cultiveerbaar zijn (Viable But None-culturable Cells (VNBC)). De VNBC-achtigecellen leken niet in een dormante toestand te verkeren maar vertoonden een zekere activiteit als bleek uit de graad van verzadiging van membraanvetzuren. Bovendien vertoonden deze cellen een hoge PAH-afbraakactiviteit zoals gesuggereerd door modellering en transcriptoomanalyse. Deze laatste gaf een sterk verhoogde expressie van genen (tot 133-voudig) weer die betrokken zijn in PAH-afbraak na inoculatie en tevens van genen betrokken bij stressrespons. Dit geeft aan dat een substantieel deel van de cellen stress ondervonden in de bodem.
Een gelijkaardige methodiek werd gehanteerd voor de fysiologische en transcriptionele respons van LH128op een gebrek aan nutriënten. LH128 past zich aan de starvatie door celgrootte te verminderen, celvorm te veranderen en de graad van verzadiging van membraanvetzuren te verhogen. Bijkomend werd een verhoogde expressie van genen coderend voor effluxsystemen of betrokken bij het aanwendenvan opgeslagen reserves waaronder rRNA en vetzuren waargenomen, alsook een verlaagde expressie van genen coderend voor biosynthese van ribosomale proteïnen, chromosomale replicatie en celdeling.
In een laatste deel werd een wholecell bioreporter geconstrueerd in LH128 door een transcriptionele fusie van de promotor regio van phnA1f</> met gfp</>en dit ter detectie van PAH-biodegradatieactiviteit en de biobeschikbare fractie van PAHs in de bodem. Deze ontwikkelde reporterstam, LH128PGFP, liet toe PAHs aanwezig in vloeibare culturen en in met PAH verontreinigde bodems zowel op agar als in microcosmos te detecteren. Deze snelle en eenvoudige bioreportergebaseerde diagnostiek benadering ter detectie van biobeschikbare PAHs kan een interessant gereedschap zijn voor beleidsmakers bij het monitoren van bioremediatieactiviteiten en de efficiëntie ervan.
We kunnen algemeen besluiten dat Sphingomonas</> sp. LH128 verschillende kenmerken vertoont van adaptatie aan abiotische stress zonder een verlies van PAH-afbraakactiviteit. De combinatie van het behoud van activiteit en een snelle adaptatie aan stresscondities maakt dat LH128 en mogelijk ook andere Sphingomonas</> stammen kunnen bijdragen aan biodegradatie van polluenten of als whole cell biosensor toepassingen in gecontamineerde milieus die regelmatig aan abiotischestress worden blootgesteld.
Datum:1 okt 2008 → 31 jan 2013
Trefwoorden:Polycyclic aromatic hydrocarbons, Biofilm, Soil treatment, Stresses, Biodegradation
Disciplines:Engineering van biomaterialen, Biologische systeemtechnologie, Biomateriaal engineering, Biomechanische ingenieurswetenschappen, Andere (bio)medische ingenieurswetenschappen, Milieu ingenieurswetenschappen en biotechnologie, Industriële biotechnologie, Andere biotechnologie, bio-en biosysteem ingenieurswetenschappen, Duurzaamheids- en milieutechniek, Biochemie en metabolisme, Medische biochemie en metabolisme, Microbiologie, Systeembiologie, Laboratoriumgeneeskunde
Project type:PhD project