Functionele karakterisatie van long non-coding RNAs van FLC homologen in Brachypodium

Vernalisatie is het fenomeen, waargenomen bij verschillende soorten planten,  waarbij een langdurige koude periode de bloeitijd van planten in de volgende lente beïnvloedt. In Arabidopsis thaliana is het FLOWERING LOCUS C (FLC), de centrale repressor van bloeitijd, die gereguleerd wordt door verschillende regulatiewegen. Na vernalisatie wordt FLC epigenetisch onderdrukt. Drie verschillende klassen van long non-coding RNAs (lncRNAs) zijn betrokken bij de FLC repressie. Eén klasse van deze lncRNAs, COOLAIR, wordt in antisense van FLC tot expressie gebracht als reactie op koude. Ondanks een relatief lage sequentieovereenkomst zijn de COOLAIR expressiepatronen en in vitro RNA secundaire structuur sterk geconserveerd binnen de familie Brassicaceae die 50 miljoen jaar geleden ontstaan zijn. Het is echter onduidelijk of COOLAIR gelijkaardige functies bevat in ver verwante soorten zoals de eenzaadlobbigen die 150 miljoen jaar geleden uiteen geëvolueerd  zijn. We hebben in deze studie 3 FLC homologen geidentificeerd in Brachypodium distachyon waarvan één homoloog, BdODDSOC2, ook functioneel bestudeerd werd tijdens vernalizatie. In dit proefschrift willen we het functioneel belang van lncRNAs begrijpen in eenzaadlobbigen door gebruik te maken van het modelsysteem B. distachyon.

In hoofstuk 2 bestuderen we het functionele belang van de FLC homologen in B. distachyon niet alleen tijdens vernalizatie maar gedurende de gehele levenscyclus van de plant. Er werd gefocust op het gen BdODDSOC2. Er zijn drie FLC homologen in B. distachyon: BdODDSOC1, BdODDSOC2 en BdMADS37. We bestuderen de functie van BdODDSOC2 gedurende vernalisatie met behulp van een bdoddsoc2 T-DNA lijn in de facultatieve vernalisatie accessie Bd21-3 en RNAi lijnen in de winter accessie BdTR3C. We zien dat de bdoddsoc2 T-DNA lijn in bepaalde omstandigheden later kiemt. Ook na  verschillende periode van narijpen werd er een zwakke late kieming geobserveerd. Echter, voor de BdODDSOC2 RNAi lijnen werd er geen duidelijk fenotype voor bloeitijd of bladnummer vastgesteld. We hebben ook geprobeerd om CRISPR / Cas9 transgene lijnen aan te maken voor dit gen. Dit is echter niet gelukt. We concluderen dat de functie van BdODDSOC2 tijdens vernalisatie en andere condities nog verder onderzocht moet worden.

In hoofdstuk 3 willen we onderzoeken of de lncRNAs hun overeenkomstige FLC homologen reguleren. Hiervoor identificeren we de antisense lncRNAs van de FLC homologen in verschillende eenzaadlobbige soorten die geen seuentie-overeenkomst met A. thalianaCOOLAIR vertonen. Net zoals bij COOLAIR vonden we dat BdODDSOC1 antisense (BdCOOLAIR1) en BdODDSOC2 antisense (BdCOOLAIR2) geïnduceerd worden door koude in een B. distachyon winter accessie. Over alle B. distachyon accessies heen zijn de sequenties van BdCOOLAIR1 en BdCOOLAIR2 minder geconserveerd dan exonen maar meer dan de flankerende gebieden. Dit suggereert een functie van het transcript zelf.  Het uitschakkelen van BdODDSOC2 dat BdCOOLAIR2 niet overlapt, heeft geen morfologisch fenotype tot gevolg maar resulteert in een significant hogere expressie van BdODDSOC2 tijdens koude. Dit geeft aan dat BdCOOLAIR2 een regulerende rol in cis uitvoerd op de onderdrukking van het BdODDSOC2 gen. Deze functionele gelijkheid tussen twee- en eenzaadlobbigen toont conservatie of covergente evolutie van FLC antisense transcriptie aan. Beide scenarios ondersteunen het functioneel belang.

Om het belang van de secundaire RNA structuur van de lncRNAs te onderzoeken pasten we in hoofdtsuk 4 een dimethyl sulfaat (DMS) RNA structuur probing methode toe in de modelplant B. distachyon. We bevestigden dat in B. distachyon, DMS specifiek de ongebonden A en C nucleotiden van het RNA modificeert. We toonden eveneens aan dat de DMS behandeling bij verschillende temperaturen kan gebruikt worden waardoor deze techniek ook gebruikt kan worden om van koude geïnduceerde lncRNAs hun RNA structuur te bepalen. Het DMS protocol werkt goed voor rRNAs die in een hoge concentratie voorkomen. Echter, deze techniek werkt nog te inefficïent voor de structuurbepaling van lage concentratie RNA moleculen. Om deze efficientie te verbeteren, hebben we een doelwit specifieke dimethylsulfaat mutatie profilering doormiddel van sequencing (DMS-MaPseq) toegepast op het lncRNA BdCOOLAIR2. Ondanks het succesvol detecteren van enkele geïnduceerde mutaties is DMS-MaPseq nog steeds niet gevoelig genoeg om de secundaire structuur van het in lage concentratie aanwezige lncRNA BdCOOLAIR2 volledig in kaart te brengen. Deze mutaties waren niet reproduceerbaar in twee verschillende analyses. Na een discussie met andere labs was de conclusie dat we BdCOOLAIR2 RNA niet efficient amplificeerden en modificeerden. Dit DMS profilering doormiddel van sequencing zal in de toekomst nog verder op punt gezet moeten worden.

Kortom, we hebben het functionele belang van FLC homologen in B. distachyon verder onderzocht. We identificeerden lncRNAs uit de FLC homologen in eenzaadlobbigen. Onder hen is BdCOOLAIR2, het antisense lncRNA van BdODDSOC2. Dit kan de silencing snelheid van BdODDSOC2 reguleren, hetgeen wijst op conservatie of convergente evolutie van FLC antisense transcriptie tussen tweezaadlobbige en eenzaadlobbige soorten. We voerden voorbereidende werkzaamheden uit om een betrouwbaar protocol voor RNA-structuur bepaling in B. distachyon te optimaliseren, wat nuttig zal zijn om het functionele belang van lncRNAs te begrijpen op structureel niveau.