Ethyleensignaaloverdracht gedurende climacterische rijping van tomatenvruchten

Tomaat (Solanum lycopersicum L.) is een gewas met een grote economische waarde dat, een hoge voedingswaarde heeft en wereldwijd word geproduceerd. Naast dat tomaat veel vitaminen en mineralen bevat, is het rijk aan andere bioactieve componenten, inclusief carotenoïden en polyfenolen. Daarnaast is het, dankzij zijn korte levenscyclus, het relatief kleine genoom en de beschikbaarheid van een grote genenbank inclusief diverse mutanten, een ideaal modelsysteem voor het bestuderen van vruchtontwikkeling en vruchtrijping al dan niet onder invloed van (a)biotische stressfactoren. Het controleren van ethyleen tijdens de naoogstfase is van belang om correcte rijpingscondities aan te leggen en zo de vruchtkwaliteit beter te sturen. Een goed begrip van de ethyleenperceptie door de vrucht is hierbij essentieel.

Het doel van deze thesis was het verkrijgen van inzichten in de dynamische veranderingen die plaatsvinden tijdens de ethyleensignaaloverdracht gedurende de climacterische rijping van tomaat, om zo op termijn de kwaliteit en bewaarbaarheid van tomaten na de oogst te verbeteren.

Ethyleen wordt in eerste instantie gebonden door de ethyleen receptoren (ETRs). Deze receptoren tezamen met de CTR-eiwitten remmen de werking van EIN2, die een sleutelrol speelt in de ethyleensignaaloverdracht en op zijn beurt ethyleen gerelateerde transcriptiefactoren in de celkern activeert. In deze thesis werd een genexpressieanalyse uitgevoerd op basis van RT-qPCR van alle gekende SlETRs en SlCTRs, waarbij vruchtrijping aan de plant werd vergeleken met de rijping van geplukte vruchten al dan niet behandeld met de ethyleenremmer 1-methylcyclopropeen (1-MCP). Geplukte vruchten vertoonden tijdens hun rijping een andere regulatie dan rijpende vruchten aan de plant terwijl de behandeling met 1-MCP de expressie van sommige genen meer remde dan die van andere genen. De resultaten suggereren dat sommige genen ethyleengevoeliger zijn dan anderen, en dat hun precieze samenspel verantwoordelijk is voor het uiteindelijk verloop van de rijping.

Om de onderliggende regulatie en de fysiologische response volledig te begrijpen werd de expressiedata aangevuld met een kwantitatieve analyse van de receptor-eiwitten die effectief verantwoordelijk zijn voor de ethyleensignaaloverdracht. Hiervoor was nog geen gevestigde techniek voorhanden, en waren tot voor kort slechts enkele van deze receptoreiwitten gekwantificeerd met behulp van western blot-analyse. Daarom werd een nieuwe techniek op punt gesteld vertrekkend vanuit een massaspectrometrische exploratieve techniek met een veelvuldig gefractioneerd peptidestaal van tomaat. Dit stelde ons in staat 8,588 eiwitten te identificeren, resulterend in één van de grootste eiwitdatasets voor Solanum lycopersicum L. tot nu toe. De complete dataset werd geannoteerd middels GO en KEGG databanken, waarbij de eiwitten werden onderverdeeld op grond van hun cellulaire locatie en hun biologische rol. Tussen deze eiwitten bevonden zich vier ethyleen receptoren, drie SlCTRs en SlEIN2.

Op grond van deze resultaten werd een gericht massaspectrometrisch protocol op punt gesteld volgens het principe van parallelle reactiemonitoring (PRM). Met deze techniek konden alle zeven SlETRs, drie van de vier SlCTRs en SlEIN2 worden geïdentificeerd en gekwantificeerd. Hun eiwit- en hun genexpressieniveaus werden bepaald in vruchten van vier verschillende rijpheidsstadia. Op grond hiervan werd geconcludeerd dat een aantal receptoren en CTRs voornamelijk rijping initiëren, terwijl anderen voornamelijk de voortgang van de rijping controleren. Het niveau aan SlEIN2, zowel in termen van mRNA als eiwit, nam af tijdens de rijping. Dit kan gerelateerd zijn aan eiwitafbraak en de verplaatsing van EIN2 naar de celkern nadat ethyleen heeft gebonden aan de receptoren.

Tenslotte wilden we het effect van temperatuur op de regulatie van de ethyleensignaaloverdracht tijdens vruchtrijping bestuderen. Hiervoor werd een bewaarexperiment opgezet waarbij volgroeide groene vruchten bij drie temperaturen werden bewaard en opgevolgd. Hierbij werden kleur, stevigheid, ethyleen productie, ademhaling, genexpressie en kwantificatie van de eiwitten betrokken bij de ethyleensignaaloverdracht, ACS en ACO enzymactiviteit en ACC en MACC accumulatie. Met deze resultaten is er een beter inzicht verkregen in de regulatie van de ethyleensignaaloverdracht mede dankzij de multiomics-aanpak en de link met de ethyleenbiosynthese.

Tot besluit werd er enerzijds een werkbaar en reproduceerbaar protocol ontwikkeld voor het identificeren en kwantificeren van de eiwitten betrokken bij de ethyleensignaaloverdracht. Anderzijds werden de receptoren, SlCTRs en SlEIN2 gekarakteriseerd met behulp van een multiomics-aanpak die verbeterde inzichten verschaften in de regulatie van de ethyleensignaaloverdracht tijdens climacterische rijping van tomaat.