< Terug naar vorige pagina
Project
Effect van Mycoplasma-enzymen op de antivirale en anti-kanker activiteit van nucleoside-analogen.
Kanker treft jaarlijks meer dan 3 miljoen personen in Europa en vormt de belangrijkste doodsoorzaak op cardiovasculaire aandoeningen na (gegevens van De Wereldgezondheidsorganisatie). De behandeling van kanker kan bestaan uit een chirurgische ingreep, bestraling, immunotherapie, hormonale therapieën, chemotherapie of een combinatie van deze toepassingen. Hedendaagse chemotherapie steunt grotendeels op de toediening van chemisch gemodificeerde nucleosiden (nucleoside analogen, NAs) met als doelde tumorcellen te doden of hun celdeling te remmen. Na intracellulaire activatie (meestal via één of meerdere fosforylaties), werken NAs als antimetabolieten van natuurlijke nucleotiden en interfereren op die manier met het nucleo(s)(t)ide metabolisme en de DNA/RNA synthese van de tumorcellen. Aangezien in volwassenen het merendeel van de gezonde cellen zich niet in het celdelingsproces bevindt, kan men met een NA-gebaseerde behandeling een zeker niveau van selectiviteit t.o.v. tumorcellen bereiken.
In de micro-omgeving van een tumor bevinden zich niet enkel tumorcellen maar ook residentiële of geïnfiltreerde niet-getransformeerde cellen. Daarenboven blijken ook verschillende prokaryoten zichte associëren met tumoren. Zo werd een preferentiële kolonisatie van tumorweefsel in vergelijking met gezond of niet-getransformeerd ziekteweefsel waargenomen voor verschillende mycoplasma soorten (bv. Mycoplasma hyorhinis</>). Dit is wellicht toe te schrijven aan het hoge aantal nutriënten in de nabijheid van een tumor (bijvoorbeeld t.g.v. necrose), bacteriële chemotaxis of gewijzigde verdedigingsmechanismen van de tumorcellen waardoor ze vatbaarder zijn voor bacteriële infecties. Mycoplasmas zijn de kleinste zelf-replicerende organismen, bezitten een sterk gereduceerd genoom en zijn, in tegenstelling tot de meeste prokaryoten, niet omgeven door een celwand. Hoewel bepaalde mycoplasmas behoren tot de residentiële flora van het menselijke lichaam, zijn een aantal soorten duidelijk ziekteverwekkend (bv. Mycoplasma pneumoniae</> en Mycoplasma genitalium</>). Mycoplasma-gerelateerde pathogenese treedt evenwel voornamelijk op in immuun-gecompromitteerde personen zoals AIDS patiënten. Door hun beperkt aantal genen kunnen de meeste mycoplasmas zelf geen pyrimidines en purines de novo</> aanmaken. Hierdoor zijn ze grotendeels afhankelijk van het gastheerweefsel waaruit ze efficiënt nucleïnezuur precursoren opnemen om ze vervolgens te metaboliseren met behulp van salvage</> enzymen. We hypothetiseerden daarom dat een mycoplasma infectie de beschikbaarheid en het metabolisme van nucleo(s)(t)iden in tumorcellen significant zou kunnen beïnvloeden.
De cytostatische en antivirale activiteit van verschillende NAs werd drastisch beïnvloed in mycoplasma-geïnfecteerde celculturen door de expressie van mycoplasma-gecodeerde nucleoside fosforylasen (NPs). Deze enzymen katalyseren de fosforolyse van pyrimidine- en purine-gebaseerde NAs en, afhankelijk van de eigenschappen van de nucleobase dievrijkomt na dergelijke afbraak, resulteerde dit in een verhoogde of verlaagde biologische activiteit van de moleculen. Die kon vervolgens weer hersteld worden door toevoeging van mycoplasma-gerichte antibiotica of specifieke NP inhibitoren. Gezien de gerapporteerde prevalentie van deze bacteriën in tumorweefsel en het regelmatig voorkomen van secundaire mycoplasma infecties in immuun-gecompromiteerde patiënten, verloopt nucleoside-gebaseerde chemotherapie van kanker en van virale infecties mogelijksuboptimaal. Daarom werd in dit werk de invloed van een mycoplasma infectie op de biologische activiteit van NAs in detail onderzocht. In eerste instantie werden het thymidine fosforylase (TP) </>en het purine nucleoside fosforylase (PNP)</> van M. hyorhinis</> gekloneerd en de recombinante proteïnen gekarakteriseerd.
M. hyorhinis TP</> codeert voor een breed-substraat nucleoside fosforylase dat, in tegensteling tot de meeste TPs, de fosforolyse katalyseert van zowel 2-deoxyriboside- als riboside-gebaseerde pyrimidinenucleosiden. De kinetische eigenschappen van dit enzym werden bepaald waaruit verrassend bleek dat uridine het voorkeurssubstraat is, gevolgd door thymidine. Ondanks de grote gelijkenissen met zowel humaan als Escherichia coli</> TP, dient dit mycoplasma enzym daarom als een pyrimidine nucleoside phosphorylase (PyNP-Hyor) te worden geannoteerd en niet als een TP. Het voorkomen van een dergelijk enzym werd reeds gerapporteerd voor een beperkt aantal andere prokaryoten (bv. Geobacillus stearothermophilus</>) en de parasiet Giardia lamblia</>. PyNP-Hyor katalyseert tevens de omzetting van verschillende therapeutische 5-gehalogeneerde pyrimidine nucleosiden (bv. floxuridine) naar hun (vaak minder actieve) nucleobasen. Dit verklaart de verminderde antivirale en cytostatische activiteit van dergelijke moleculen in mycoplasma-geïnfecteerde celculturen.
Fosforolyse van purine-gebaseerde antikanker middelen werd eveneens aangetoond in mycoplasma-geïnfecteerde cellen. Afhankelijk van de vrijgezette purine nucleobase, resulteert dit in een sterk verminderde (zoals waargenomen voor cladribine) of een sterk verhoogde (zoals waargenomen voor fludarabine) cytostatische activiteit. Toevoeging van mycoplasma-gerichte antibiotica of een selectieve PNP inhibitor herstelde de activiteit van dergelijke moleculen. Het recombinantePNP van M. hyorhinis</> (PNP-Hyor) werd bestudeerd en bleek alle natuurlijke purine nucleosiden (xanthosine uitgezonderd) en verschillende purine-gebaseerde NAs met therapeutische toepassingen te accepteren.Aangezien (2-deoxy)adenosine en derivaten hiervan over het algemeen niet geaccepteerd worden als substraat voor humaan PNP, zou de aanwezigheid van mycoplasmas in een tumor een selectieve fosforolyse van dergelijke moleculen kunnen veroorzaken. Eliminatie van mycoplasmas of inhibitievan mycoplasma PNP zou daarom de therapeutische index van stoffen zoalscladribine kunnen verhogen. Anderzijds zou men door een rationele keuzevoor geneesmiddelen die activiteit winnen na fosforolyse (bv. fludarabine), een meer selectieve therapie kunnen bekomen.
Vervolgens werd een verminderde cytostatische activiteit van het veelgebruikte antikanker middel gemcitabine vastgesteld in M. hyorhinis</>-geïnfecteerde celculturen. Dit kon worden toegeschreven aan de expressievan een mycoplasma (2-deoxy)cytidine deaminase dat de omzetting van gemcitabine naar zijn, biologisch minder actieve, gedeamineerde metabolietkatalyseert. De cytostatische activiteit van gemcitabine kon onverwachtook hersteld worden door inhibitie van mycoplasma PyNP, hoewel dit molecule geen direct substraat is voor NP-gekatalyseerde fosforolyse. Er werd bovendien geen verminderde activiteit van gemcitabine waargenomen in celculturen wanneer deze geïnfecteerd werden met een PyNP-deficiente mycoplasma stam. Hoewel het exacte werkingsmechanisme nog niet geheel opgehelderd werd, onderzochten we of PyNP expressie in mycoplasma-geïnfecteerde tumorcellen resulteert in een gewijzigd pyrimidine nucleo(s)(t)ide metabolisme (bv. verlaagde dTTP en verhoogde dCTP spiegels) dat de activatie van gemcitabine en soorgelijke moleculen door 2-deoxycytidine kinase (dCK) kan remmen. Het is momenteel onduidelijk of deze dNTP spiegels wel degelijk voldoende gewijzigd zijn in de mycoplasma-geïnfecteerde tumorcel culturen om zulk effect op het dFdC activerend enzym te veroorzaken. Onze bevindingen dat het cytostatisch activiteitsverlies van dFdC o.i.v. mycoplasmas kan opgeheven worden met de PyNP inhibitor TPI, zouden misschien ook kunnen verklaard worden indien we aannemen dat een hecht multi-enzym complex van catabole pyrimidine salvage enzymen [nl. PyNP en (2-deoxy)cytidine deaminase] in mycoplasmas voorkomt. Dit is momenteel nog zeer hypothetisch en vereist verder onderzoek.
Gezien de compromitterende rol die mycoplasma PyNP kan spelen in de cytostatische activiteit van thymidine analogen, werd in een volgende fase onderzocht of fluoropyrimidine-gebaseerde therapie kan worden geoptimaliseerd door de ontwikkeling van een prodrug die resistent is tegen NP-gekatalyzeerde fosforolyse. In samenwerking met prof. C. McGuigan (Cardiff University, Cardiff, UK), hebben we de fosforamidaat prodrug (ProTide) technologie toegepast om derivaten te maken van floxuridine-5-monofosfaat, de actieve metaboliet van floxuridine. Introductie van een naftyl/benzyl-L-alaninyl fosfaat motief resulteerde in een prodrug (NUC-3073) die niet langer vatbaar is voor afbraak door humane en prokaryote NPs. Integenstelling tot floxuridine, behield NUC-3073 inderdaad biologische activiteit in mycoplasma-geïnfecteerde celculturen. Daarenboven bleek de intracellulaire omzetting van NUC-3073 naar floxuridine-5-monofosfaat onafhankelijk van thymidine kinase (TK) te gebeuren. Dit nieuw chemotherapeuticum zou daarom een alternatief kunnen bieden voor floxuridine (dat snel wordt afbroken door NPs en daarom slechts beperkt wordt toegediend)en zou kunnen toegepast worden in de behandeling van TK-deficiënte tumoren. NUC-3073 zal in 2014 getest worden in fase 1 klinische studies voorde behandeling van colorectale kanker.
Vervolgens werd eenuniversele inhibitor van zowel pyrimidine als purine NPs ontworpen engeëvalueerd. Het merendeel van de tot hiertoe gesynthetiseerde NP inhibitoren zijn nucleoside derivaten met modificaties in de nucleobase. Dergelijke moleculen inhiberen daarom zeer specifiek één type NP. We hebben echter als vertrekpunt (2-deoxy)ribose-1-fosfaat, het gemeenschappelijke product van alle NP-gekatalyseerde reacties, genomen en vonden dat3,5,-dichlorobenzoyl-gesubstitueerd 2-deoxy-D-ribose-1-fosfaat (Cf2891)zowel humane als prokaryote NPs inhibeert. Dit molecule treedt in competitie met anorganisch fosfaat om de verschillende NPs te binden en, afhankelijk van het type NP, observeerden we competitieve of niet-competitieve inhibitie met nucleosiden. Cf2891 kan gebruikt worden voor de ontwikkeling van krachtiger breed-substraat NP inhibitoren die eventueel kunnenworden toegepast om simultaan pyrimidine- en purine-gebaseerde NAs te beschermen tegen enzymatische afbraak wanneer ze als combinatietherapie zouden worden toegediend.
In dit werk werd met behulp van mycoplasma-geïnfecteerde tumorcellen de relatie tussen een mycoplasma infectie en de efficiëntie van therapeutische NAs bestudeerd. Een mycoplasmainfectie in tumoren (of een secundaire opportunistische infectie in immuun-gecompromitteerde patiënten) zou dus de therapeutische index van pyrimidine- en purine-gebaseerde NAs kunnen beïnvloeden. In vivo</>studies bevestigden dat de antitumor activiteit van gemcitabine en floxuridine inderdaad sterk verminderd is in mycoplasma-geïnfecteerde tumoren in vergelijking met niet-geïnfecteerde tumoren in muizen. Gezien de experimentele beperkingen inzake het co-cultiveren van (niet-mycoplasma) prokaryoten met zoogdiercellen is het momenteel niet duidelijkof onze resultaten ook van toepassing zijn op andere bacteriële infecties. Door rationele keuze voor NP-resistente (pro)drugs of voor een combinatietherapie van NAs met (i) mycoplasma-gerichte antibiotica of (ii) specifieke inhibitoren van katabole mycoplasma enzymen, kan de efficiëntievan huidige chemotherapeutica geoptimaliseerd worden in celcultuur. Eenklinische validatie van dit principe zou kunnen leiden tot een meer efficiënte nucleoside-gebaseerde kankerbehandeling.
In de micro-omgeving van een tumor bevinden zich niet enkel tumorcellen maar ook residentiële of geïnfiltreerde niet-getransformeerde cellen. Daarenboven blijken ook verschillende prokaryoten zichte associëren met tumoren. Zo werd een preferentiële kolonisatie van tumorweefsel in vergelijking met gezond of niet-getransformeerd ziekteweefsel waargenomen voor verschillende mycoplasma soorten (bv. Mycoplasma hyorhinis</>). Dit is wellicht toe te schrijven aan het hoge aantal nutriënten in de nabijheid van een tumor (bijvoorbeeld t.g.v. necrose), bacteriële chemotaxis of gewijzigde verdedigingsmechanismen van de tumorcellen waardoor ze vatbaarder zijn voor bacteriële infecties. Mycoplasmas zijn de kleinste zelf-replicerende organismen, bezitten een sterk gereduceerd genoom en zijn, in tegenstelling tot de meeste prokaryoten, niet omgeven door een celwand. Hoewel bepaalde mycoplasmas behoren tot de residentiële flora van het menselijke lichaam, zijn een aantal soorten duidelijk ziekteverwekkend (bv. Mycoplasma pneumoniae</> en Mycoplasma genitalium</>). Mycoplasma-gerelateerde pathogenese treedt evenwel voornamelijk op in immuun-gecompromitteerde personen zoals AIDS patiënten. Door hun beperkt aantal genen kunnen de meeste mycoplasmas zelf geen pyrimidines en purines de novo</> aanmaken. Hierdoor zijn ze grotendeels afhankelijk van het gastheerweefsel waaruit ze efficiënt nucleïnezuur precursoren opnemen om ze vervolgens te metaboliseren met behulp van salvage</> enzymen. We hypothetiseerden daarom dat een mycoplasma infectie de beschikbaarheid en het metabolisme van nucleo(s)(t)iden in tumorcellen significant zou kunnen beïnvloeden.
De cytostatische en antivirale activiteit van verschillende NAs werd drastisch beïnvloed in mycoplasma-geïnfecteerde celculturen door de expressie van mycoplasma-gecodeerde nucleoside fosforylasen (NPs). Deze enzymen katalyseren de fosforolyse van pyrimidine- en purine-gebaseerde NAs en, afhankelijk van de eigenschappen van de nucleobase dievrijkomt na dergelijke afbraak, resulteerde dit in een verhoogde of verlaagde biologische activiteit van de moleculen. Die kon vervolgens weer hersteld worden door toevoeging van mycoplasma-gerichte antibiotica of specifieke NP inhibitoren. Gezien de gerapporteerde prevalentie van deze bacteriën in tumorweefsel en het regelmatig voorkomen van secundaire mycoplasma infecties in immuun-gecompromiteerde patiënten, verloopt nucleoside-gebaseerde chemotherapie van kanker en van virale infecties mogelijksuboptimaal. Daarom werd in dit werk de invloed van een mycoplasma infectie op de biologische activiteit van NAs in detail onderzocht. In eerste instantie werden het thymidine fosforylase (TP) </>en het purine nucleoside fosforylase (PNP)</> van M. hyorhinis</> gekloneerd en de recombinante proteïnen gekarakteriseerd.
M. hyorhinis TP</> codeert voor een breed-substraat nucleoside fosforylase dat, in tegensteling tot de meeste TPs, de fosforolyse katalyseert van zowel 2-deoxyriboside- als riboside-gebaseerde pyrimidinenucleosiden. De kinetische eigenschappen van dit enzym werden bepaald waaruit verrassend bleek dat uridine het voorkeurssubstraat is, gevolgd door thymidine. Ondanks de grote gelijkenissen met zowel humaan als Escherichia coli</> TP, dient dit mycoplasma enzym daarom als een pyrimidine nucleoside phosphorylase (PyNP-Hyor) te worden geannoteerd en niet als een TP. Het voorkomen van een dergelijk enzym werd reeds gerapporteerd voor een beperkt aantal andere prokaryoten (bv. Geobacillus stearothermophilus</>) en de parasiet Giardia lamblia</>. PyNP-Hyor katalyseert tevens de omzetting van verschillende therapeutische 5-gehalogeneerde pyrimidine nucleosiden (bv. floxuridine) naar hun (vaak minder actieve) nucleobasen. Dit verklaart de verminderde antivirale en cytostatische activiteit van dergelijke moleculen in mycoplasma-geïnfecteerde celculturen.
Fosforolyse van purine-gebaseerde antikanker middelen werd eveneens aangetoond in mycoplasma-geïnfecteerde cellen. Afhankelijk van de vrijgezette purine nucleobase, resulteert dit in een sterk verminderde (zoals waargenomen voor cladribine) of een sterk verhoogde (zoals waargenomen voor fludarabine) cytostatische activiteit. Toevoeging van mycoplasma-gerichte antibiotica of een selectieve PNP inhibitor herstelde de activiteit van dergelijke moleculen. Het recombinantePNP van M. hyorhinis</> (PNP-Hyor) werd bestudeerd en bleek alle natuurlijke purine nucleosiden (xanthosine uitgezonderd) en verschillende purine-gebaseerde NAs met therapeutische toepassingen te accepteren.Aangezien (2-deoxy)adenosine en derivaten hiervan over het algemeen niet geaccepteerd worden als substraat voor humaan PNP, zou de aanwezigheid van mycoplasmas in een tumor een selectieve fosforolyse van dergelijke moleculen kunnen veroorzaken. Eliminatie van mycoplasmas of inhibitievan mycoplasma PNP zou daarom de therapeutische index van stoffen zoalscladribine kunnen verhogen. Anderzijds zou men door een rationele keuzevoor geneesmiddelen die activiteit winnen na fosforolyse (bv. fludarabine), een meer selectieve therapie kunnen bekomen.
Vervolgens werd een verminderde cytostatische activiteit van het veelgebruikte antikanker middel gemcitabine vastgesteld in M. hyorhinis</>-geïnfecteerde celculturen. Dit kon worden toegeschreven aan de expressievan een mycoplasma (2-deoxy)cytidine deaminase dat de omzetting van gemcitabine naar zijn, biologisch minder actieve, gedeamineerde metabolietkatalyseert. De cytostatische activiteit van gemcitabine kon onverwachtook hersteld worden door inhibitie van mycoplasma PyNP, hoewel dit molecule geen direct substraat is voor NP-gekatalyseerde fosforolyse. Er werd bovendien geen verminderde activiteit van gemcitabine waargenomen in celculturen wanneer deze geïnfecteerd werden met een PyNP-deficiente mycoplasma stam. Hoewel het exacte werkingsmechanisme nog niet geheel opgehelderd werd, onderzochten we of PyNP expressie in mycoplasma-geïnfecteerde tumorcellen resulteert in een gewijzigd pyrimidine nucleo(s)(t)ide metabolisme (bv. verlaagde dTTP en verhoogde dCTP spiegels) dat de activatie van gemcitabine en soorgelijke moleculen door 2-deoxycytidine kinase (dCK) kan remmen. Het is momenteel onduidelijk of deze dNTP spiegels wel degelijk voldoende gewijzigd zijn in de mycoplasma-geïnfecteerde tumorcel culturen om zulk effect op het dFdC activerend enzym te veroorzaken. Onze bevindingen dat het cytostatisch activiteitsverlies van dFdC o.i.v. mycoplasmas kan opgeheven worden met de PyNP inhibitor TPI, zouden misschien ook kunnen verklaard worden indien we aannemen dat een hecht multi-enzym complex van catabole pyrimidine salvage enzymen [nl. PyNP en (2-deoxy)cytidine deaminase] in mycoplasmas voorkomt. Dit is momenteel nog zeer hypothetisch en vereist verder onderzoek.
Gezien de compromitterende rol die mycoplasma PyNP kan spelen in de cytostatische activiteit van thymidine analogen, werd in een volgende fase onderzocht of fluoropyrimidine-gebaseerde therapie kan worden geoptimaliseerd door de ontwikkeling van een prodrug die resistent is tegen NP-gekatalyzeerde fosforolyse. In samenwerking met prof. C. McGuigan (Cardiff University, Cardiff, UK), hebben we de fosforamidaat prodrug (ProTide) technologie toegepast om derivaten te maken van floxuridine-5-monofosfaat, de actieve metaboliet van floxuridine. Introductie van een naftyl/benzyl-L-alaninyl fosfaat motief resulteerde in een prodrug (NUC-3073) die niet langer vatbaar is voor afbraak door humane en prokaryote NPs. Integenstelling tot floxuridine, behield NUC-3073 inderdaad biologische activiteit in mycoplasma-geïnfecteerde celculturen. Daarenboven bleek de intracellulaire omzetting van NUC-3073 naar floxuridine-5-monofosfaat onafhankelijk van thymidine kinase (TK) te gebeuren. Dit nieuw chemotherapeuticum zou daarom een alternatief kunnen bieden voor floxuridine (dat snel wordt afbroken door NPs en daarom slechts beperkt wordt toegediend)en zou kunnen toegepast worden in de behandeling van TK-deficiënte tumoren. NUC-3073 zal in 2014 getest worden in fase 1 klinische studies voorde behandeling van colorectale kanker.
Vervolgens werd eenuniversele inhibitor van zowel pyrimidine als purine NPs ontworpen engeëvalueerd. Het merendeel van de tot hiertoe gesynthetiseerde NP inhibitoren zijn nucleoside derivaten met modificaties in de nucleobase. Dergelijke moleculen inhiberen daarom zeer specifiek één type NP. We hebben echter als vertrekpunt (2-deoxy)ribose-1-fosfaat, het gemeenschappelijke product van alle NP-gekatalyseerde reacties, genomen en vonden dat3,5,-dichlorobenzoyl-gesubstitueerd 2-deoxy-D-ribose-1-fosfaat (Cf2891)zowel humane als prokaryote NPs inhibeert. Dit molecule treedt in competitie met anorganisch fosfaat om de verschillende NPs te binden en, afhankelijk van het type NP, observeerden we competitieve of niet-competitieve inhibitie met nucleosiden. Cf2891 kan gebruikt worden voor de ontwikkeling van krachtiger breed-substraat NP inhibitoren die eventueel kunnenworden toegepast om simultaan pyrimidine- en purine-gebaseerde NAs te beschermen tegen enzymatische afbraak wanneer ze als combinatietherapie zouden worden toegediend.
In dit werk werd met behulp van mycoplasma-geïnfecteerde tumorcellen de relatie tussen een mycoplasma infectie en de efficiëntie van therapeutische NAs bestudeerd. Een mycoplasmainfectie in tumoren (of een secundaire opportunistische infectie in immuun-gecompromitteerde patiënten) zou dus de therapeutische index van pyrimidine- en purine-gebaseerde NAs kunnen beïnvloeden. In vivo</>studies bevestigden dat de antitumor activiteit van gemcitabine en floxuridine inderdaad sterk verminderd is in mycoplasma-geïnfecteerde tumoren in vergelijking met niet-geïnfecteerde tumoren in muizen. Gezien de experimentele beperkingen inzake het co-cultiveren van (niet-mycoplasma) prokaryoten met zoogdiercellen is het momenteel niet duidelijkof onze resultaten ook van toepassing zijn op andere bacteriële infecties. Door rationele keuze voor NP-resistente (pro)drugs of voor een combinatietherapie van NAs met (i) mycoplasma-gerichte antibiotica of (ii) specifieke inhibitoren van katabole mycoplasma enzymen, kan de efficiëntievan huidige chemotherapeutica geoptimaliseerd worden in celcultuur. Eenklinische validatie van dit principe zou kunnen leiden tot een meer efficiënte nucleoside-gebaseerde kankerbehandeling.
Datum:1 jun 2008 → 2 dec 2013
Trefwoorden:Cancer
Disciplines:Microbiologie, Systeembiologie, Laboratoriumgeneeskunde, Palliatieve zorg en zorg rond het levenseinde, Regeneratieve geneeskunde, Andere basiswetenschappen, Andere gezondheidswetenschappen, Verpleegkunde, Andere paramedische wetenschappen, Andere translationele wetenschappen, Andere medische en gezondheidswetenschappen
Project type:PhD project