< Terug naar vorige pagina

Project

Effect van metabolisch gasvervoer op het centrale metabolisme van peer fruit (Pyrus communis L.): een computationele biologische-benadering.

Bijna de helft van de appelproductie (Malus x domestica Borkh.) wereldwijd is bestemd voor langdurige bewaring. Na de oogst blijven appelen metabolisch actief en rijpen ze verder. Tijdens de bewaring is het belangrijk om de metabolische activiteit en daarmee het rijpingsproces van de vruchten te vertragen. Daarom worden grote hoeveelheden appelen opgeslagen onder condities met gecontroleerde atmosfeer (CA) (lage temperatuur en lage zuurstofpartieeldruk in combinatie met hoge koolstofdioxidepartieeldruk) met recente ontwikkelingen gaande in de richting van bewaring onder dynamisch CA (DCA). Bij DCA-bewaring wordt het zuurstofniveau in de bewaarruimte gradueel verlaagd richting het anaeroob compensatiepunt, tot het moment waarop een biorespons vanuit het fruit aangeeft dat het ademhalingsmetabolisme van de vruchten te laag wordt en leidt tot fermentatie, waarna het zuurstofniveau terug verhoogd wordt. Het wijzingen van de normale atmosferische condities is echter niet zonder risico voor de vruchtfysiologie: het kan namelijk lagezuurstofstress veroorzaken. Om de technologie van DCA-bewaring verder te verbeteren, is het van belang om de volledige impact van lagezuurstofstress op de vruchtfysiologie te begrijpen.

Momenteel is er weinig bekend over hoe de lage zuurstofconcentraties de metabole processen en hun regulatie in appelen juist beïnvloeden. Daarom is de hoofddoelstelling van dit proefschrift om de metabole veranderingen van het centrale koolstofmetabolisme die geïnduceerd worden door lagezuurstofstress en hun regulatie in Jonagold-appelen te ontrafelen. Door de aanwezigheid van zuurstofgradiënten in de vrucht is de zuurstofconcentratie rond het klokhuis lager dan in het vruchtvlees net onder de schil. Om er voor te zorgen dat de zuurstofconcentraties in het vruchtweefsel overal hetzelfde zijn, werden alle experimenten uitgevoerd met dunne schijfjes appel, afkomstig van dezelfde regio in de vrucht zonder schil en klokhuis.

Als de zuurstofconcentraties in het vruchtweefsel te laag worden, zal fermentatie geïnduceerd worden, wat kan zorgen voor smaakveranderingen (bv. ethanol) en fysiologische afwijkingen in de vruchten. Momenteel is er echter weinig informatie beschikbaar over de in vivo regulatie van het fermentatiemetabolisme bij lagezuurstofstress. Op basis van in vitro experimenten werd gesuggereerd dat het fermentatiemetabolisme geregeld wordt via een moleculair en een metabolisch controlesysteem, maar experimentele omstandigheden in vitro zijn niet noodzakelijkerwijs een correcte weergave van de situatie in vivo. Daarom is de eerste focus van dit proefschrift om een beter inzicht te geven in de regulatie van het fermentatie-metabolisme in vivo bij verschillende zuurstofconcentraties en temperaturen zowel onmiddellijk na de oogst als na bewaring. Hiervoor werd gebruik gemaakt van een combinatie van experimentele technieken en kinetische modellen.

Om de in vitro activiteit van de fermentatie-enzymen, pyruvaatdecarboxylase (PDC) en alcoholdehydrogenase (ADH), correct te meten, werden meetprotocollen geoptimaliseerd om de signaal/ruis-verhouding te verhogen. Verder werd er een methode ontwikkeld, gebaseerd op een kinetisch model, om nauwkeurig de in vitro specifieke enzymactiviteit van PDC en ADH te schatten op basis van spectrofotometrische data. De modellen zijn gebaseerd of Michaelis-Menten en eerste-orde-kinetiek, die het reactiemechanisme van de enzymen beschrijven. In tegenstelling tot de lineaire regressiemethode, kunnen deze modellen worden gebruikt om de enzymactiviteit te bepalen, ongeacht of lineariteit werd bereikt, omdat ze de volledige voortgangscurve in rekening brengen. Het voordeel van het gebruikte kinetisch model is dat de maximale activiteit van het enzym kan geschat worden door extrapolatie, zelfs als de substraatverzadiging niet volledig werd gerealiseerd.

De regulatie van het fermentatiemetabolisme bleek sterk afhankelijk van de toegepaste omstandigheden. Temperatuur veranderde de algemene metabole reactiesnelheid, die op zijn beurt een grote invloed bleek te hebben op de inductie en regulatie van het fermentatiemetabolisme. Verder gaf het model aan dat de in vivo regulatie van het fermentatiemetabolisme verschillend was onder anoxische en hypoxische omstandigheden, als ook dat er een extra regulatie aanwezig was na 6 maanden bewaring. Ondanks dat het fermentatiemetabolisme duidelijk geïnduceerd werd onder alle toegepaste experimentele omstandigheden, begon de flux door het fermentatiemetabolisme weer af te nemen na langdurige lage zuurstofstress.

Om verder te onderzoeken of Jonagold-appelen de negatieve effecten van fermentatie verminderen door pyruvaat naar alternatieve routes te transporteren, werd er een gedetailleerde pathway-analyse uitgevoerd, gebaseerd op RNA-sequencing data, om de transcriptionele regulatie van het centrale koolstofmetabolisme tijdens lage zuurstofstress in meer detail te bestuderen. Hieruit bleek dat Jonagold-appelen de energiecrisis verminderen door de flux door de glycolyse te verhogen en PPi-afhankelijke reacties te bevoordelen, door koolstofatomen te sparen door pyruvaat naar het alaninemetabolisme te transporteren en door de verzuring van het cytoplasma tegen te gaan door het alaninemetabolisme en de GABA-shunt te activeren. Tenslotte, werd in dit proefschrift bewijs geleverd voor de aanwezigheid van een zuurstofwaarnemingsmechanisme in Jonagold-appelen, hetgeen aangeeft dat naast de substraatremming van de elektronentransportketen door de lage beschikbaarheid van zuurstof, een actief regulatiemechanisme van het centrale koolstofmetabolisme aanwezig is.

Datum:1 okt 2012  →  28 aug 2018
Trefwoorden:Metabolic gas, Pyrus communis L
Disciplines:Levensmiddelenwetenschappen en (bio)technologie, Landbouw, land- en landbouwbedrijfsbeheer, Biotechnologie voor landbouw, bosbouw, visserij en aanverwante wetenschappen, Visserij, Analytische chemie, Macromoleculaire en materiaalchemie, Andere chemie, Voeding en dieetkunde, Productie van landbouwdieren
Project type:PhD project