Effect van hitte en hoge druk op Bacillus cereus sporen: stamvariatie, kinetica en combinatie met de antimicrobiële component carvacrol

Bacillus cereus is een belangrijke voedselpathogeen die problemen kan veroorzaken in mild behandelde gekoelde voedingsmiddelen met verlengde houdbaarheid door de productie van hitteresistente sporen en door het vermogen van sommige stammen om te groeien bij lage temperaturen tot 4°C.  B. cereus kan twee verschillende types van voedselgebondenziektes veroorzaken, die respectievelijk gepaard gaan met braken en diarree. De taxonomie van deze bacteriën is complex en is het voorbije decennium sterk geëvolueerd. B. cereus is genetisch nauw verwant met zes andere Bacillus species, en wordt samen hiermee aangeduid als B. cereus sensu lato. Op basis van moleculair-genetische criteriawordt B. cereus sensu lato onderverdeeld in zeven fylogenetische groepen, maar deze vallen niet precies samen met de oorspronkelijke afbakening van species, en voedselpathogene stammen van B. cereus sensu stricto komen verspreid voor in minstens vier fylogenetische groepen. Een bijkomend element van complexiteit is dat ook bij de andere species van B. cereus sensu lato in toenemende mate voedselpathogenen worden gerapporteerd. Samen met de trend naar milde behandelingstechnieken in de voedingsindustrie groeit door dit nieuwe taxonomische inzicht een noodzaak aan meer gedetailleerde studies van de eigenschappen van de sporen van de verschillende fylogenetische groepen van B. cereus, in het bijzonder wat betreft hun weerstandigheid ten opzichte van traditionele en nieuwe conserveringstechnieken.In een eerste deel van dit werk werd de thermische inactivatiekinetiek van de sporen van 39 B. cereus  sensu lato stammen uit zes fylogenetische groepen (groep II t/m VII) bestudeerd bij drie of meer verschillende temperaturen en vijf verschillende procestijden in een kaliumfosfaat buffer. Overlevingscurves en temperatuurafhankelijkheidscurves werden opgemaakt en de kinetische parameters DT (decimale reductietijd bij temperatuur T) en z (temperatuurafhankelijkheid van D) werden bepaald via lineaire regressie. De meeste stammen (38/39) vertoonden inactivatiecurves zonder uitgesproken schouder of staart, met doorgaans lineaire regressiecoëfficiënten groter dan 0.95. In de meeste fylogenetische groepen werd een aanzienlijke stam tot stamvariatie vastgesteld. Sporen van psychrotolerante stammen (groep VI) vertoonden de laagste hitteresistentie, terwijl sporen van thermotolerante stammen (groep III en VII) in het algemeen het meesthitteresistent waren. Verdere analyse toonde een positieve correlatie tussen de hitteresistentie van de sporen en zowel de minimum- als de maximum-groeitemperatuur van de stammen. Omgekeerd was de z waarde negatief gecorreleerd met de minimale en maximale groeitemperatuur. De specifiekeinformatie over de hitteresistentie van de sporen behorend tot verschillende fylogenetische groepen die hier wordt gerapporteerd kan bijdragen tot een verfijning van bestaande risico-analysemodellen voor B. cereus, rekening houdend met groepsspecifiekeD en z waarden uit dit werk, en met nieuwe inzichten in de pathogeniciteit van stammen binnen elke fylogenetische groep.In een tweede deel werd het effect van hogedruk (HD) behandeling bij 600800 MPa, 2060°C en met een procestijd van 15 min bestudeerd op sporen van dezelfde verzameling van B. cereus stammen (behalve twee stammen) in kaliumfosfaat buffer. De resultaten toondendat hogedrukbehandeling zowel kieming als inactivatie van de sporen induceerde. Beide effecten vertoonden een aanzienlijke stamvariatie, maar er werden geen significante verschillen tussen de fylogenetische groepen vastgesteld. Sporeninactivatie nam slechts in beperkte mate toe met de druk (600 tot 800 MPa), en in sterkere mate met de temperatuur (20 tot 60°C). Zelfs de meest drastische procescondities volstonden echter niet voor de realisatie van een 6-D reductie, de gangbare standaard voor pasteurisatie van niet-zure voedingsmiddelen met lange gekoelde houdbaarheid.Hogedrukbehandeling bij verhoogde temperatuur (> 60°C) (HPHT) is een nieuwe ontwikkeling met potentieel voor de appertizatie van voedingsmiddelenomdat het de efficiënte inactivatie van bacteriële sporen mogelijk maakt. Er zijn echter weinig gegevens over de inactivatie van B. cereus  sporen door dit proces. Een interessante vraag, zowel vanuitfundamenteel wetenschappelijk oogpunt als met het oog op industriële toepassingen, is of en in welke mate de hogedrukcomponent van HPHT processen bijdraagt tot sporeninactivatie. In de literatuur zijn zowel synergistische als antagonistische interacties tussen druk en temperatuur gerapporteerd voor deze processen. Daaromwerd in een derde deel van dit werk de inactivatiekinetiek van B. cereus  stam F4430/73 door HPHT (600 MPa, 60-100°C) en door conventionele thermische behandeling (HT; 0.1 MPa, 60-100°C) vergeleken in MES buffer.  HT inactivatiekon worden beschreven door een eerste orde kinetisch model, terwijl HPHT inactivatie gekenmerkt werd door een snelle en een trage fase. Aanzienlijke sporeninactivatie trad op tijdens tijdens de drukopbouw en -equilibratiefase (2.0 tot 4.1 log10, bij 70100°C). HPHT inactivatie verliep aanzienlijk Sneller dan HT inactivatie, zelfs in de trage fase, die ook volgens een eerste orde kinetiek verliep. De D waarden bij 0,1 en 600 MPavertoonden ook een verschillende temperatuurs-afhankelijkheid, met significant lagere z waarden voor HT dan voor HPHT behandeling.. Deze resultaten wijzen op een sterk synergistisch effect van HP en HT op de inactivatie van B. cereus sporen, zoals dat ook in de meeste eerdere studies met sporen van andere bacteriën reeds werd vastgesteld.Tenslottewerd in een vierde deel het effect van HPHT behandeling bij verschillende temperaturen (600 MPa, 50100°C met 5°C stappen, 5 min procestijd) opde vrijstelling van dipicolinezuur (DPA) en op het verlies van refractiliteit van de sporen onderzocht, zowel in aan- als in afwezigheid van denatuurlijke antimicrobiële component carvacrol. Het doel was om op dezemanier inzichten te verwerven in de cellulaire impact van HPHT op B. cereus sporen, maar ook om de mogelijkheid te exploreren om via een hordenbenadering met deze natuurlijke component de efficiëntie van HPHT behandeling te verbeteren. De sporeninactivatie door HPHT bedroeg minder dan 1 log10 bij 50 tot 70°C, maar nam gradueel toe bij hogere temperatuur, tot ongeveer 5 log10 bij 100°C. Op basis van de vaststelling dat de vrijstelling van DPA en het verlies van refractiliteit groter waren bij gematigde (£ 65°C) dan bij hoge (≥ 70°C) temperatuur, werd de hypothese geformuleerd dat gematigde behandelingscondities de normale fysiologische kiemingsroute induceren, hetgeen resulteert in volledige hydratatie van de sporen, terwijl hogere behandelingstemperaturen deze route onderdrukken en een ander mechanisme van DPA vrijstelling induceren waarbijslechts partiële rehydratatie van de sporen optreedt, waarschijnlijk omdat de hydrolyse van de sporencortex onder deze omstandigheden wordt geïnhibeerd. Opmerkelijk was dat carvacrol de DPA vrijstelling en sporenrehydratatie sterk onderdrukte tijdens drukbehandelingen bij £ 65°C, en ook bij ≥ 65°C de DPA vrijstelling nog partieel onderdrukte. Tegelijkertijd werd de HPHT sporeninactivatie verminderd door carvacrol bij 65-90°C, maar niet beïnvloed bij 95100°C. Samenvattend kunnen we stellen dat dit werk nieuwe informatie levert over de inactivatie van die bruikbaar zal zijn voor de optimalisatie van conserveringsprocessen op basis van hitte en hoge druk. Een eerste bijdrage is de beschrijving van de variatie in resistentie van verschillende B. cereus sporen behorend tot verschillende fylogenetische groepen ten opzichte van hitte en hoge druk bij matige temperatuur. Een tweede bijdrage is de gedetailleerde kinetische analyse van de HPHT inactivatie van de sporen van een hitteresistente B. cereus  stam, waarbij een uitgesproken synergie tussen druk en hitte werd vastgesteld. De toevoeging van carvacrol versterkte niet de efficiëntie van de sporeninactivatie door HPHTbehandeling, en verminderde deze zelfs bij 65 - 90°C. Een derde en laatste bijdrage zijn de gegevens over sporenrefractiliteit en DPA vrijstelling na HPHT behandeling, waaruit de hypothese werd geformuleerd dat hogedruk de normale fysiologische kiemingsroute induceert bij temperaturen tot ongeveer 65°C, terwijl bij hogere temperaturen deze route onderdruktwordt en vervangen door een ander mechanisme van drukgeïnduceerde DPA vrijstelling.  

Trefwoorden:High temperature, High pressure

Disciplines:Levensmiddelenwetenschappen en (bio)technologie, Microbiologie, Systeembiologie, Laboratoriumgeneeskunde, Andere chemie, Voeding en dieetkunde, Productie van landbouwdieren, Engineering van biomaterialen, Biologische systeemtechnologie, Biomateriaal engineering, Biomechanische ingenieurswetenschappen, Andere (bio)medische ingenieurswetenschappen, Milieu ingenieurswetenschappen en biotechnologie, Industriële biotechnologie, Andere biotechnologie, bio-en biosysteem ingenieurswetenschappen

Project type:PhD project