Een fluorescentie-gebaseerde tool voor analyse van proteïne-proteïne-interacties en identificatie van nieuwe processen betrokken in susceptibiliteit voor fluconazol in Candida species

Candida soorten vertegenwoordigen de voornaamste commensale schimmels in de menselijke darmflora en behoren tot de top 6 meest voorkomende oorzaken van invasieve schimmelinfecties wereldwijd. Onze onderzoeksdoelstellingen zijn het beter begrijpen van de biologie die de dubbele levensstijl van deze opportunistische pathogenen kenmerkt, alsook het identificeren van efficiënte therapeutische behandelingen voor het uitroeien van Candida infecties.

De complexe proteïne-proteïne interacties (PPI) in kaart brengen is essentieel om de virulentie signalisatie en de gastheer-pathogeen interactie op moleculair niveau te begrijpen, alsook om nieuwe klinische drugsdoelwitten te identificeren. De unieke biologie van C. albicans, parasexuele voortplanting en het alternatieve codongebruik, vermoeilijken de toepassing van standaard genetische methodes. In het eerste deel van dit werk, hebben we een geoptimaliseerde bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) analyse opgesteld, een krachtige methode voor onderzoek naar PPI in C. albicans. We hebben geoptimaliseerde plasmiden ontworpen die het N- en C-terminale labelen van interessante proteïnen toelaten om hun interacties in alle fusierichtingen te analyseren. Nadat dit bevestigd is door middel van een ‘bewijs van principe’ opstelling, hebben we BiFC toegepast op de cAMP proteïne kinase A (PKA) pathway, één van de centrale signaaltransductiepathways die morfogenese en virulentie in C. albicans besturen. Voor het eerst hebben we de in vivo interactie van de voorafgaande componenten van de cAMP-PKA pathway, de Gpr1-Gpa2 module, alsook de interactie van Bcy1-Tpk1 en Bcy1-Tpk2, de regulatorische en katalytische componenten van het PKA-complex gevisualiseerd. De toepassing van BiFC voor in vivo visualisatie en onderzoek van PPI is veelbelovend voor het ophelderen van nieuwe moleculaire mechanismen in C. albicans.

In het tweede deel van dit werk, probeerden we nieuwe processen te identificeren die tussenkomen in de vatbaarheid van C. glabrata voor fluconazole. Gezien de waargenomen epidemiologische verschuiving van meer azole-vatbare C. albicans naar meer azole-resistente C. glabrata infecties, focust ons onderzoek op de moleculaire mechanismen voor resistentie tegen fluconazole, de meest gebruikte azole. Door een collectie van C. glabrata deletie-mutanten te screenen, hebben we twee groepen met mutanten geïdentificeerd die de fluconazole-vatbaarheid van C. glabrata verbeteren en onderdrukken. Fenotypische profilering van de geïdentificeerde mutanten biedt inzicht in nieuwe processen verantwoordelijk voor fluconazole-vatbaarheid en resistentie in gist.