< Terug naar vorige pagina

Project

Dynamiek in het centrale plantencel-metabolisme

Planten hebben, als onderdeel van hun ontwikkeling, aanpassingsmechanismen verworven om het hoofd te bieden aan voorkomende stress-situaties. Eén van deze mechanismen is het vermogen hun metabolisme aan te passen aan extreme condities zoals een lage zuurstofspanning. De beschikbaarheid van zuurstof (O2) is voor hogere planten van belang voor hun energievoorziening via het ademhalingsmetabolisme. Wanneer O2 beperkend wordt, kan het hierdoor onderdrukte ademhalingsmetabolisme leiden tot een verminderde groei. Lage O2-condities kunnen optreden als gevolg van zowel omgevingsinvloeden (bv. overstroming) als ook menselijk ingrijpen (bv. tijdens bewaring van vruchten en groenten onder gecontroleerde atmosfeer (CA)). Verder kan de anatomische structuur van een plant aanleiding geven tot een ongelijke gasverdeling resulterend in lage zuurstofcondities in het binnenste weefsel van een plant. Lagezuurstofstress kan onder meer leidentot een geremde groei van veldgewassen en de ontwikkeling van bewaargebreken tijdens CA-bewaring van fruit. Gezien het belang van plantaardige voeding, is het belangrijk inzicht te verkrijgen in hoe planten omgaan met lage zuurstof stress.
De hoofddoelstelling van deze thesis is het beter begrijpen van het effect van lage O2 op planten via analyses van het metaboloom en het fluxoom. De metaboloomanalyse betreft een alomvattende analyse van alle metabolieten in een organisme met een laag molecuulgewicht terwijl de fluxoomanalyse inzicht geeft in de snelheid van omzettingen doorheen een reactienetwerk. Deze technieken kunnen samen gebruikt worden om de respons van planten op lagezuurstofstress te bestuderen en beter te begrijpen.
Fluxanalyse, gebruik makend van isotopen, vereist het voeden van een organisme met gelabelde substraten om vervolgens de inbouw van dit label in de verschillende metabolieten op te meten. In intacte planten is de toepassing van voedingsexperimenten beperkt door de lange incubatietijden die nodig zijn om meetbare hoeveelheden label inte bouwen in biopolymeren zoals eiwitten en koolhydraten. Om dit probleem te omzeilen werd gebruik gemaakt van een modelsysteem van heterotrofe celsuspensieculturen die zich makkelijk laten vermeerderen en die veel sneller gelabeled substraat inbouwen in hun metaboloom.
In het eerste deel van deze thesis werden technieken ontwikkeld voor het maken van een celsuspensiecultuur vertrekkende van tomatenbladeren. Vervolgens is er een protocol op punt gesteld voor het scheiden, identificeren en kwantificeren van intracellulaire polaire metabolieten met behulp van gaschromatografie massaspectrometrie en de accumulatie van het label tijdens 13C-labelvoedingsexperimenten. Uiteindelijk werden er 13C-label- voedingsexperimenten uitgevoerd om het effect van lage O2 stress op het polaire metabolietprofiel en de veranderingen in de fluxen doorheen het centraal koolstofmetabolisme van de tomatencellen te kwantificeren. Dit werd gedaan onder zowel dynamische condities als tijdens stabiele evenwichtscondities.
De celsuspensiecultuur werd verkregen uit een in het donker gegenereerd los callus van tomatenbladeren (Lycopersicum esculentum L. var </>cerasiforme). De groeicurve van de celsuspensiecultuur omvat een incubatieperiode, een lineaire groeifase en een stationaire fase. De polaire celmetabolieten werden gescheiden en gedetecteerd op de GC-MS na een methanolextractie en derivatisatie met behulp van N,O-bis-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide. In totaal werden 70 polaire metabolieten geïdentificeerd en gekwantificeerd tijdens een 40 minuten durend temperatuursprogramma. De polaire celmetabolieten omvatte aminozuren, organische zuren, suikers en suikeralcoholen. Na afloop van de voedingsexperimenten werd in 47 van de 70 metabolieten 13C-label aangetroffen.
De metabole respons van plantencellen op lagezuurstofstress werd bestudeerd door de veranderingen in de polaire metabolieten te analyseren tijdens blootstelling in een bioreactor aan verschillende O2-niveaus. De cellen werden geïncubeerd bij 21, 1 of 0 kPa O2. Gedurende 12uur werden er elk uur stalen genomen met een laatste staalname 24 uur na aanvang van de incubatie. Vier uur na de start van de incubatie werd er 13C-gelabeld glucose toegevoegd aan het groeimedium. De veranderingen in metabolietniveaus en de inbouw van 13C-label werd opgemeten met de GC-MS. Lagezuurstofstress wijzigde de samenstelling van het polair metabolietprofiel van de cellen. Er was een algemene reductie van de concentraties aan aminozuren, organische zuren en suikers en een toename van de intermediairen van de glycolyse, lactaat en een aantal suikeralcoholen. Veder veroorzaakt lagezuurstofstress voor nagenoeg alle metabolieten een reductie van de hoeveelheid ingebouwd label, uitgezonderd voor lactaat ensommige suikeralcoholen. Deze resultaten duiden erop dat lagezuurstofstress in plantencellen leidt tot een activatie van het fermentatiemetabolisme en de synthese van suikeralcoholen terwijl de citroenzuurcyclus gereduceerd wordt. Tevens werden de concentraties van die metabolieten die zijn afgeleid van de intermediairen van het centraal koolstofmetabolisme, zoals aminozuren, gereduceerd onder lage O2 stress.
Om kwantitatiefinzicht te verkrijgen in de respons van het fluxoom op de blootstellingaan lagezuurstofstress in plantencellen werd er aan de hand van waargenomen veranderingen in metabolietniveaus en de inbouw van 13C-label een wiskundig dynamisch model opgesteld van het centraal koolstofmetabolisme. Er werd een gecompartimentaliseerd metabolisch netwerkmodel opgesteld van de glycolyse (in het cytosol en de plastiden), de citroenzuurcyclus (in de mitochondriën) en de synthese van alanine, aspartaat, lactaat, glutamaat, serine, sucrose en valine. Het model omvat differentiaalvergelijkingen voor zowel Michaelis-Menten- als eerste-ordekinetiek. De modelparameters werden geschat met de niet-lineaire kleinstekwadratenmethode. Het dynamisch model toonde aan dat de incubatie onder lage O2 leidde tot een significante reductie in de opnamesnelheid van glucose. Lagezuurstofstress veroorzaakte tevens een reductie in de activiteit van verschillende enzymen van de citroenzuurcyclus resulterend in een accumulatie van de intermediairen van de glycolyse. Een verhoogde fluxvan de lactaat- en ethanolsynthese weerspiegelde het toegenomen belang van het fermentatiemetabolisme voor de realisatie van een voldoende energieproductie tijdens lagezuurstofstress. Een analyse van de netto energieproductie toonde dat de hoeveelheid ATP geproduceerd bijde verschillende O2 behandelingen gelijkaardig is, alhoewel de ATP-productie bij de lage O2-conditie ten koste ging van een veel hoger substraatverbruik. Met behulp van een metabolecontrole-analyse van de glycolyse,de fermentatie en de citroenzuurcyclus werd duidelijk dat de opnamefluxvan extern glucose bepalend is voor de meeste fluxen van het centraal koolstofmetabolisme terwijl de opnameflux van pyruvaat naar de mitochondriën bepalend is voor de activiteit van de citroenzuurcyclus. Verder oefenen enzymen die concurreren om een gemeenschappelijk substraat een negatieve controle uit op elkaar.
Onder aanname van een stabiel evenwicht werd een fluxanalyse uitgevoerd gebruik makend van de 13C-label die was ingebouwd in de vrije intracellulair metabolieten. Dit in plaats van een conventionele aanpak waarbij wordt vertrokken van de label ingebouwd in de eiwitgebonden aminozuren. Op deze manier konden lange incubatietijden nodig voor het bereiken van een stabiele evenwichtssituatie op het niveau van de concentraties en de labelinbouw in biopolymeren worden vermeden. Voor deze fluxanalyse werd de celsuspensiecultuur geïncubeerd in een bioreactor bij O2-niveaus van 21, 8, 5 of 0 kPa totdat er een stabiele evenwichtssituatie op het niveau van de concentraties en de labelinbouw werd bereikt (24 h na de start van het experiment). De celmetabolieten werden geëxtraheerd met methanol, gederivatiseerd met behulp van N-(tert-butyldimethylsilyl)-trifluoroacetamide en geanalyseerd met de GC-MS. De hoeveelheid 13C-label ingebouwd in de metabolieten van het centraal koolstofmetabolisme, aminozuren en suikers werd bepaald. De fluxen werden geschat met behulp van de 13CFLUX2 software. De evenwichtsrespons op lagezuurstofstress was gelijkaardig aan hetgeen wat was waargenomen in het dynamische experiment: een afname in desubstraat opname, een toename van het fermentatiemetabolisme en een gereduceerde citroenzuurcyclus en aminozuursynthese. Tenslotte werden op grond van de berekende fluxen de dynamische en de evenwichtsgebaseerde modelbenaderingen met elkaar vergeleken. De dynamische modelaanpak biedt een aantal voordelen, waaronder de meer gedetailleerde informatie die wordt verkregen ten aanzien van de structuur en de regulatie van het metabool netwerk onder de verschillende stresscondities en de tijdsafhankelijkheid van de stressrespons. De evenwichtsaanpak is echter geschikt voor het snel verkrijgen van een overzicht van de belangrijkste veranderingen in het metabolisme in response op stress in die systemen waar een stabielevenwicht kan worden verondersteld op het niveau van metaboliet concentraties en de hoeveelheid ingebouwde label.
Datum:1 okt 2009 →  2 jul 2014
Trefwoorden:Central plant cell metabolism
Disciplines:Plantenbiologie
Project type:PhD project