FO-SPR-bioassay-ontwikkeling voor specifieke en gevoelige analyse van extracellulaire blaasjes

Extracellulaire vesikels (EV's) trekken steeds meer de aandacht van onderzoekers vanwege hun cruciale rol in intercellulaire communicatie en signaaltransductie. Ondanks het groot potentieel van EV’s in medische diagnostiek en therapie dienen er nog heel wat uitdagingen aangepakt te worden vooraleer toepassingen in een klinische context mogelijk zijn.  Momenteel is één van de grootste uitdagingen het gebrek aan standaardisatie, wat vaak resulteert in inter-laboratorium variaties en vertekende analyses. Bovendien zijn de bestaande EV-detectiemethoden ofwel niet gevoelig genoeg of specifiek genoeg, of kunnen ze niet rechtstreeks werken met complexe matrices. Daarom was het doel van deze scriptie het ontwikkelen van gestandaardiseerde vezeloptische oppervlakteplasmonresonantie (FO-SPR) bioassays voor specifieke en gevoelige analyse van EV's in complexe matrices, waardoor toepassingen in de toekomst als diagnostisch hulpmiddel in de kliniek mogelijk worden. Dit werd gedaan door gebruik te maken van een FO-SPR biosensor, een meetapparaat die ontwikkeld werd als een zeer competitief alternatief voor conventionele SPR-technologieën vanwege de goedkope sensoren, het lage vereiste staalvolume, de snelheid van meting en de mogelijkheid voor directe detectie in complexe matrices.

In een eerste stap werd de FO-SPR biosensor gestandaardiseerd voor specifieke en gevoelige EV-detectie door het apparaat te kalibreren met recombinante EV's (rEV's) rechtstreeks in celcultuurmedium (CCM) en bloedplasma. Er werd voor de eerste maal een FO-SPR sandwich bioassay gebouwd met een 2-stap-signaalversterkingsstrategie door gebruik te maken van een biotine-gebonden detectie-antilichaam en goudnanodeeltjes gefunctionaliseerd met een anti-biotine-antilichaam. Hiermee werden opmerkelijke detectielimietwaarden bereikt die 103 keer lager waren dan de verwachte fysiologische concentratie van EV's in menselijk plasma en 104 keer lager dan de EV-concentratie in het plasma van kankerpatiënten. De ontwikkelde sandwich bioassay werd vervolgens onderzocht op specifieke detectie van rEV's, HEK293T endogene EV's en MCF7 cel-geïsoleerde EV's in CCM en bloedplasma.

Vervolgens werd de opgezette FO-SPR EV-detectie bioassay verder uitgebreid naar het detecteren van borstkanker specifieke EV's direct in bloedplasma. Borstkankercellijnen SK-BR-3 en MCF7 werden respectievelijk gebruikt als model systemen voor borstkanker biomerkers HER2 en EpCAM. De verkregen detectielimieten in bloedplasma toonden een opmerkelijke gevoeligheid van de opgestelde bioassays aan. Belangrijker nog, de specificiteit van de bioassays werd aangetoond met behulp van plasmastalen van gezonde vrijwilligers waarvan niet bekend was dat ze werden gediagnosticeerd met borstkanker. Dit werk toonde aan dat, in vergelijking met andere SPR-gebaseerde platformen, het FO-SPR platform uitstekende perspectieven biedt om de kloof tussen laboratorium en klinische setting te overbruggen in het gebruik van EV's als biomerkers voor vroege (kanker) diagnostiek.

In de laatste fase werd de FO-SPR biosensor gebruikt om de C-X-C chemokine receptor type 4 (CXCR4) voor het eerst te valideren als een algemene EV biomerker, door ook gebruik te maken van andere technologieën, zoals het SPR platform als gouden standaard (BiacoreTM) en de ExoView. De expressie van CXCR4 werd aangetoond op EV's geïsoleerd van 7 verschillende cel lijnen met BiacoreTM SPR technologie op een label-vrije wijze. Met behulp van de opgestelde FO-SPR sandwich bioassay konden CXCR4-expressende EV's direct gedetecteerd worden in CCM, terwijl tegelijkertijd ook de colocalisatie van CXCR4 met algemene EV oppervlakte biomerkers werd onthuld. Tot slot ondersteunden de resultaten met de ExoView biosensor deze bevindingen op individueel EV niveau.

Deze scriptie benadrukt het belang van het gebruik van pre-geëvalueerde biologische referentiematerialen om robuuste en specifieke EV detectie bioassays te ontwikkelen en zo interlaboratorium variaties en vertekende analyses te elimineren. De verkregen resultaten illustreerden (1) de opmerkelijke gevoeligheid van het FO-SPR apparaat, (2) het vermogen om EV's direct in complexe matrices te meten, (3) het vermogen om kanker-specifieke EV's te onderscheiden van andere en (4) de mogelijkheid om colocalisatie analyse uit te voeren om de oppervlakte moleculaire samenstelling van EV's te onthullen. Al deze aspecten, gecombineerd met andere eigenschappen van de FO-SPR biosensor, tonen aan dat het een groot potentieel heeft voor het EV onderzoek en dat het toepassingsmogelijkheden heeft als een klinisch hulpmiddel in de toekomst.