< Terug naar vorige pagina

Project

Dengue virus infectie van endotheelcellen: Pathogenese en glycosaminoglycanen als antiviraal doelwit

Dengue virussen (DENV) zijn positief-georiënteerde enkelstrengige RNA virussen die tot de familie van de Flaviviridae behoren, samen met andere belangrijke humane pathogenen (waaronder gele koorts virus en West-Nijl virus). Dengue wordt momenteel beschouwd als de belangrijkste virale aandoening in mensen die door geleedpotigen wordt overgedragen. Vier genetisch verschillende, maar serologisch verwante serotypes (DENV 1-4) worden overgedragen op de mens door muggen van het genus Aedes in meer dan 100 landen in tropische en subtropische gebieden in Zuidoost-Azië, Amerika en Afrika. De voornaamste dengue vector is Aedes aegypti, terwijl Aedes albopictus fungeert als een secundaire vector. Meer dan 2,5 miljard mensen leven in gebieden die getroffen worden door dengue en men schat dat jaarlijks 390 miljoen DENV infecties optreden. Het DENV ziektebeeld varieert van een milde, koortsige aandoening die dengue koorts (DK) wordt genoemd tot een ernstige en mogelijks levensbedreigende aandoening, genaamd dengue hemorrhagische koorts (DHK)/dengue shock syndroom (DSS). De symptomen van DK omvatten plotse, hoge koorts (>39°C), hoofdpijn, misselijkheid, overgeven, uitslag en spier- en gewrichtspijnen; terwijl DHK/DSS gekarakteriseerd wordt door verhoogde vasculaire permeabiliteit, die resulteert in plasmaverlies, trombocytopenie en coagulopathie. Ondanks jarenlang onderzoek, werden de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor het DENV-geïnduceerde plasmaverlies nog niet opgehelderd. Het gemak waarmee bloedstalen verzameld worden heeft onderzoekers ertoe aangezet om te focussen op de rol van immuuncellen en oplosbare mediatoren. Deze studies hebben geleid tot de identificatie van dendritische cellen, monocyten en macrofagen als de voornaamste DENV doelwitcellen. Hoewel endotheelcellen (EC) de binnenste laag van de bloedvaten aflijnen en de uitwisseling van gassen, vloeistoffen en opgeloste stoffen tussen de bloedvaten en de omringende weesfels dirigeren, werd een actieve deelname van het endotheel in de pathogenese van DENV slechts recent in overweging genomen. DENV antigenen en viraal RNA, indicatief voor virusreplicatie, werden aangetoond in EC in verscheidene organen (long, milt, lever, hart en hersenen) met behulp van immunohistologische technieken en in situ hybridisatie. Daarom was het doel van deze studie om (i) de infectie van microvasculaire endotheelcellen door DENV te onderzoeken, (ii) de respons van verschillende EC types na infectie door DENV 1-4 te vergelijken en (iii) inhibitoren van DENV infectie van EC te evalueren.

 

In Hoofdstuk 2 hebben we onderzocht of primaire microvasculare EC (HMVEC-d) en de geïmmortaliseerde EC lijn HMEC-1 geïnfecteerd kunnen worden door DENV, omdat DENV-geïnduceerd plasmaverlies optreedt ter hoogte van het microvasculaire endotheel. We toonden voor het eerst aan dat microvasculaire EC permissief zijn voor infectie door en replicatie van DENV, hoewel de goed beschreven DENV receptoren DC-SIGN (op dendritische cellen) of de mannose receptor and Fcγ-receptor (op monocyten/macrofagen) afwezig zijn op deze cellen. De bevinding dat infectie van EC door DENV geblokkeerd kan worden met natuurlijke glycosaminoglycanen (GAG), inclusief heparine en heparaan sulfaat, suggereerde dat heparaan sulfaat-bevattende proteoglycanen (HSPG) betrokken zijn in de infectie van EC. Met behulp van flow cytometrie toonden we aan dat HSPG sterk tot expressie worden gebracht op deze cellen en dat een sterke afname in het aantal geïnfecteerde cellen werd waargenomen wanneer heparaan sulfaat enzymatisch werd verwijderd. Deze resultaten tonen aan dat  infectie van ECs door DENV-2 gemedieerd wordt door HSPG. De klinische toepassingen van heparine en heparine analogen zijn echter beperkt door de anticoagulerende activiteit van deze moleculen. Daarom werd de antivirale activiteit van gesulfateerde derivaten van het K5 capsulair polysaccharide van Escherichia coli tegen DENV-2 in HMEC-1 en HMVEC-d cellen onderzocht. Het K5 polysaccharide heeft dezelfde structuur als de biosynthetische precursor van heparine maar vertoont geen anticoagulerende activiteit. We vonden een sterk antiviraal effect  voor de hoog gesulfateerde K5-OS(H) en K5-N,OS(H) derivaten met EC50 waarden in het nanomolaire bereik. ‘Time-of-addition’ en aanhechting/entry assays toonden aan dat deze moleculen de vroege stappen in de infectiecyclus van DENV inhiberen. Verder toonden we aan dat de K5 derivaten de fusie van C6/36 muggencellen inhiberen door de interactie met het DENV envelop (E) eiwit. Met behulp van ‘surface plasmon resonance’ (SPR) analyses toonden we de binding van K5-OS(H) en K5-N,OS(H) op het DENV E protein domein III (E DIII) aan, dat het receptor bindend domein van DENV bevat. Bovendien verhinderden de sterk gesulfateerde K5 derivaten de binding van het E DIII op geïmmobiliseerd heparine, hetgeen het infectieproces van microvasculaire EC door DENV nabootst. Ten slotte inhibeerden K5-OS(H) en K5-N,OS(H) de infectie van dendritische cellen door DENV. Samengevat tonen deze resultaten aan dat sterk gesulfateerde K5 derivaten kunnen beschouwd worden als een nieuwe klasse van antivirale middelen tegen DENV, hoewel hun activiteit tegen de andere DENV serotypes nog dient bevestigd te worden.

 

In Hoofdstuk 3 werd de antivirale activiteit van chemokine peptides onderzocht. Aangezien DENV infectie van EC gemedieerd wordt door HSPG, zouden positief geladen peptiden in competitie kunnen treden voor de binding op heparaan sulfaat. Chemokines zijn afhankelijk van de binding op GAGs op EC voor het creëren van een chemokine gradient, die vereist is voor de recrutering van immuuncellen naar de plaats van productie. De binding van chemokines op GAGs wordt gemedieerd door clusters van basische aminozuren in de carboxy-terminus van de chemokines en de negatief geladen sulfaat/carboxylgroepen in HSPGs. De CXC chemokines, CXCL9 en CXCL12γ, hebben een karakteristieke basische carboxy-terminus and bevatten meerdere hepaan sulfaat bindingsmotieven. Daarom werd eerst de binding van verschillende COOH-terminale CXCL9 en CXCL12γ peptides op heparine gekarakteriseerd met behulp van SPR analyse. Deze data toonden aan dat de positief geladen peptides hoge bindingsaffiniteit vertonen voor geïmmobiliseerd heparine, met uitzondering van CXCL9(86-103) waarin 2 vermoedelijke HS bindingsplaatsen ontbreken. Bovendien waren de CXCL9 en CXCL12γ peptides in staat om in competitie te treden voor de binding op heparine met CXCL8, een sterke heparine binder. Omdat voor verschillende virussen werd aangetoond dat ze HSPG gebruiken als aanhechtingsreceptor op de doelwitcellen, werd een kleine antivirale screen uitgevoerd met de chemokine peptides. In deze screen vertoonden de chemokine peptides antivirale activeit bij micromolaire concentraties tegen herpes simplex virus type 1 (HSV-1), respiratoir syncytium virus (RSV) en DENV-2. SPR analyse werd gebruikt om de competitieve binding tussen de CXCL9 peptides en DENV E DIII op geïmmobiliseerd heparine te bestuderen. Hierbij werd aangetoond dat het CXCL9(74-103) peptide sneller bindt op heparine dan DENV E DIII en als dusdanig de interactie tussen DENV E DIII en heparine  verhindert, wat de anti-DENV-2 activiteit van het peptide kan verklaren. Deze resultaten suggereren verder dat de positief geladen carboxy-terminale CXCL9 en CXCL12γ chemokine peptides kunnen gebruikt worden als ‘lead compounds’ voor de ontwikkeling van een nieuwe categorie van antivirale middelen die gericht zijn op de interactie tussen virussen en HPSG.

 

In Hoofdstuk 4 hebben we getracht om de effecten van DENV 1-4 infectie te vergelijken in  EC van verschillende oorsprong. Tegenstrijdige resultaten werden gerapporteerd inzake de infectiegraad en de respons van EC na DENV infectie. Bovendien bemoeilijkt het gebruik van EC van verschillende oorsprong het vergelijken van de bekomen resultaten. De meeste data werden bekomen met DENV-2, en in mindere mate met DENV-4, terwijl slechts enkele studies het effect van DENV-1 of -3 rapporteerden. Daarom infecteerden we de microvasculaire cellijn HMEC-1 en de primaire microvasculaire (HMVEC-d) en macrovasculair (HUVEC) EC met stammen van de vier DENV serotypes: DENV-1 Djibouti, DENV-2 NGC, DENV-3 H87 and DENV-4 Dak. DENV-4 was het meest infectieuze serotype, gevolgd door DENV-2, DENV-1 en DENV-3. Het hoogste percentage geïnfecteerde cellen werd bekomen in HMEC-1 cellen, terwijl de infectie van primaire HMVEC-d en HUVEC cellen resulteerde in vergelijkbare, maar lagere infectiegraden. We toonden aan dat de waargenomen verschillen in infectiegraad  correleren  met de expressie van HS op het oppervlak van deze cellen. Met behulp van een ‘custom-made’ Bio-Plex assay kwantificeerden we de hoeveelheid van 18 cytokines die betrokken zijn in de regulatie van EC permeabiliteit of de rekrutering en/of activatie van immuuncellen. Infectie van EC door DENV 1-4 resulteerde in een sterke opregulatie van IL-6, MCP-1, RANTES, CXCL9, CXCL10 en CXCL11. Bovendien werd een tijdsafhankelijk cytopathogeen effect waargenomen in alle EC types na infectie door DENV 1-4. Specifieke apoptosis testen detecteerden de translocatie van fosfatidylserine naar de extracellulaire zijde van het plasmamembraan in DENV 1-4-geïnfecteerde HMEC-1 cellen en de activatie van caspase-3 in DENV-4-geïnfecteerde HMEC-1 en HUVEC cellen. Om het effect van directe infectie van EC op vasculaire permeabiliteit na te gaan, werd de integriteit van een HUVEC monolaag tijdens infectie door DENV-4 opgevolgd in real-time. We merkten op dat DENV-4 infectie van EC de celindex van de monolaag niet veranderde in vergelijking met de niet-geïnfecteerde cellen. Echter, wanneer de DENV-4-geïnfecteerde cellen werden gestimuleerd met TNF-α 24 uur na  infectie, werd een sterke daling in de cell index waargenomen, in vergelijking met de niet-geïnfecteerde EC die behandeld werden met TNF-α. Deze resultaten suggereren dat DENV infectie EC gevoelig maakt voor het permeabiliteitsinducerende effect van TNF-α, hoewel het onderliggende mechanisme nog dient opgehelderd te worden.

Datum:1 sep 2009 →  29 sep 2015
Trefwoorden:Dengue virus, Infections
Disciplines:Microbiologie, Systeembiologie, Laboratoriumgeneeskunde
Project type:PhD project