Defecten van het aangeboren immuunsysteem in de mens: diagnose van genetische aandoeningen in de NF-κB signalisatiecascade

Primaire immuundeficiënties zijn aangeboren aandoeningen die kinderen en volwassen vatbaar maken voor recidiverende bacteriële, virale en/of schimmelinfecties. Kennis over deze ziektes is nog zeer beperkt binnen de eerstelijns gezondheidszorg. Dit zorgt ervoor dat veel patiënten te laat een diagnose krijgen waardoor aangepaste therapie niet op tijd opgestart kan worden om levensbedreigende infecties te voorkomen. Toll-like/IL-1R (TIR) receptoren en de geassocieerde NF-κB signalisatiecascade zijn belangrijke mediatoren van het aangeboren immuunsysteem. Het begrijpen van hun functie in humane cellen is enorm belangrijk omdat genetische defecten in deze signalisatiecascade lijden tot invasieve pyogene bacteriële infecties, herpes simplex encephalitis, ‘common variable immunodeficiency’, chronische mucocutane candidiasis, en gecombineerde immuundeficiëntie.

In het eerste deel van deze studie bekeken we de waarde van TLR/NF-κB-specifieke functionele testen in het klinisch laboratorium.

In Hoofdstuk 1 evalueerden we via ELISA de IL-6 productie door PBMCs na 24 uur stimulatie met diverse TIR liganden in 770 patiënten met een verhoogde vatbaarheid voor infecties. Referentiewaarden, bepaald met behulp van het Bhattacharya algoritme, lieten ons toe om 22 patiënten te identificeren met een functioneel afwijkende IL-6 productie, waaronder één IRAK-4 deficiënte en twee NEMO-ID patiënten. De andere 19 patiënten, die geen mutatie hadden in IRAK4, MYD88, en IKBKG, vertoonden een fenotype gelijkend op een milde vorm van IRAK-4/MyD88 deficiëntie.

Hoofdstuk 2 concentreerde zich op het ontwikkelen van een snelle flow cytometrische screeningstest die kan gebruikt worden voor genetische defecten in de canonische NF-κB pathway. Deze test, gebaseerd op de evaluatie van IκB-α degradatie, kan reeds gebruikt worden voor het diagnosticeren van IRAK-4, MyD88-, and CARD11-deficiënties. Verder onderzoek naar de functionaliteit bij andere genetische NF-κB defecten is nog aan de gang (studie in samenwerking met Hôpital Necker, Parijs).

Hoewel functionele testen zeer handig kunnen zijn, blijft moleculaire diagnostiek de gouden standaard voor de diagnose van deze aandoeningen. In het tweede deel van het onderzoek bekeken we daarom genetische methoden die gebruikt kunnen worden om ziekte-veroorzakende mutaties te identificeren in het aangeboren immuunsysteem.

In Hoofdstuk 3 werd er een robuuste sequencing techniek op punt gesteld die toelaat om IKBKG, IRAK4, en MYD88 voor verschillende patiënten in één run na te kijken. We deden dit door SMRT sequencing op de PacBio RSII (Pacific Biosciences) te vergelijken met ‘Sequencing-by-Synthesis’ op de  Hiseq 2500 (Illumina). IKBKG/NEMO werd specifiek bekeken omdat het gen moeilijk te sequencen is door de aanwezigheid van het homologe pseudogen IKBKGP1.

Hoofdstuk 4 beschrijft drie patiënten waarbij een genetische diagnose gevonden werd via Sanger sequencing. In twee patiënten werd een IKBKG mutatie gevonden. In een derde patiënt, waarbij NEMO-deficiëntie werd uitgesloten, werd een ‘gain-of-function’ mutatie in het STAT1 gen geïdentificeerd. We bestudeerden de pathologische impact van deze mutaties en hun bijdrage aan het immunologische fenotype van de patiënten.

Hoofdstuk 5 beschrijft de toepassing van een ‘next-generation sequencing’ methode waarbij een panel van 174 PID genen in één keer wordt gesequenced. Deze techniek wordt in ons centrum toegepast sinds 2014. Met behulp van dit panel konden we IRAK-4 deficiëntie diagnosticeren in een volwassen vrouw waarvan oorspronkelijk gedacht werd dat ze leed aan een autosomaal dominante vorm van het hyper-IgE syndroom.

In Hoofdstuk 6 worden patiënten beschreven waarbij een defect in het aangeboren immuunsysteem vermoed werd en waarbij ‘whole exome sequencing’ werd opgestart om nieuwe genetische defecten te identificeren. 25 patiënten met recidiverende pyogene bacteriële infecties werden onderzocht. In 5 van deze patiënten werd een mutatie gevonden in het TNFRSF13B gen. Dit gen werd reeds eerder geassocieerd is met ‘common variable immunodeficiency’. Twee patiënten met een onbekende syndromale immuundeficiëntie werden eveneens onderzocht. De eerste patient leed aan X-linked Kabuki syndroom veroorzaakt door een nieuwe hemizygote de novo mutatie in het KDM6A gen. Een homozygote mutatie in het TRNT1 gen werd geïdentificeerd in de tweede patiënt die leed aan een ernstige immuundeficiëntie met gastro-intestinale inflammatie en B-cel immuundeficiëntie.

In deze studie evalueerden we verschillende diagnostische strategieen die kunnen gebruikt worden in klinische en genetische laboratoria voor de identificatie van defecten van het aangeboren immuunsysteem.