De rol van Smad1/5 gemedieerde TGFbeta/BMP signaling in bloedvat- en lymfevatontwikkeling.

De vorming van het cardiovasculair en lymfatisch netwerk is cruciaal voor normale ontwikkeling en fysiologie. In deze thesis onderzoeken we het lymfatisch systeem dat een belangrijke rol speelt in de opname van het interstitiële vocht en de vetopname in de dunne darm, maar ook in het immuunsysteem. Het falen in de totstandkoming van een lymfatisch netwerk leidt tot ernstige embryonale defecten, terwijl een misregulatie na de geboorte kan leiden tot aandoeningen zoals kanker metastase, lymfoedeem, obesitas en ontstekingsziekten. De eerste lymfevat endotheelcellen (LECs) differentiëren van veneuze ECs in de cardinale vene en brengen lymfatische merkers tot expressie zoals o.a. PROX1 en LYVE1. PROX1 wordt aanzien als de cruciale regulator van lymfangiogenese en eliminatie van PROX1 in muizen leidt tot een compleet gebrek aan lymfevaten en vroege embryonale sterfte.

De Notch signaalweg is een belangrijke regelaar van het lot van de cell ("cell fate") en van patroonvorming in meerdere weefsels en speelt een cruciale rol in angiogenese. De rol van de Notch signaalweg in lymfangiogenese is echter niet helemaal begrepen. Sommige groepen beschrijven dat Notch onontbeerlijk is voor lymfevat ontwikkeling, terwijl anderen een inhiberend effect van Notch op lymfangiogenese aantonen. Wij beschrijven hier dat een neerregulatie van NOTCH1 in humane dermale LECs (DLECs) -  in de context van BMP9 signalering - resulteerde in verlaagde PROX1 expressie waarden, wat suggereert dat de Notch signaalweg lymfevat ontwikkeling positief reguleert.

De BMP signaalweg heeft zich ontpopt tot een fundamentele signaalweg in EC identiteit en het reguleert zo de cardiovasculaire en lymfatische ontwikkeling. SMAD1, -5 en -8 zijn BMP mediatoren die geactiveerd worden door fosforylatie en vervolgens de transcriptie van doelwitgenen reguleren zoals bvb de IDs. Mutaties in componenten van deze signaalweg leiden tot verscheidene vasculaire ziekten zoals erfelijk hemorragische teleangiëctasie (HHT) en pulmonale arteriële hypertensie (PAH). Bovendien hebben muizen met een deletie van BMP9 of diens receptor, ALK1, gedilateerde lymfevaten, wat duidt op een inhiberende rol voor de BMP signaalweg in lymfevat ontwikkeling.

De objectieven waren om I) de mogelijke interactie tussen de BMP and Notch signaalwegen te onderzoeken, II) om de regionale verschillen in BMP-SMAD transciptionele activiteit te documenteren en III) om het effect van SMAD1/5 op de LEC identiteit en specificatie te bestuderen.

In deze studie, toonden we een synergie aan tussen de Notch en BMP signaalwegen. Neerregulatie van SMAD1/5 of NOTCH1 in DLECs leidde tot verlaagde expressie waarden van zowel Notch als BMP responsieve genen.

We documenteerden hier de regionale verschillen in BMP-SMAD afhankelijke transcriptie activiteit in muis endotheel. Voor deze analyse gebruikten we de BRE::gfp reporter muis waarin BMP respons elementen (BRE) van de ID1-promotor, een doelwit gen van SMAD1/5/8, de expressie van groen fluorescent proteïne (GFP) aandrijft. We omschreven regio's met stereotype mozaïek en continue BRE::gfp lokalisatiepatronen in nieuwgevormde bloedvaten en embryonale lymfevaten, en de dynamische verandering van reporter activiteit in functie van de tijd.

Daarenboven toonden we in de muis dat LEC-specifieke deletie van Smad1/5 leidt to embryo's met vergrootte lymfezakken met meer PROX1-positieve cellen, en ook in postnatale mutante pups werd PROX1 niet neergereguleerd in lymfevat endotheel  in de regio tussen de lymfekleppen. In tegenstelling tot deze in vivo resultaten, vonden we geen verschil in PROX1 mRNA en proteïne waarden in gecultiveerde humane dermale LECs (DLECs) waarin SMAD1/5 met siRNA werd neergereguleerd en die vervolgens met BMP9 werden gestimuleerd, terwijl een siRNA gemedieerde neerregulering van ALK1 wel verhoogde PROX1 expressie waarden opleverden in vergelijking met controle cellen. Deze discrepantie tussen de in vivo and in vitro data suggereert dat PROX1 niet (alleen) gereguleerd wordt via ALK1-SMAD1/5 signalering. Opmerkelijk is dat depletie van ALK1 en SMAD1/5 in DLECs de waarden van PROX1 niet aantast. Dit suggereert dat SMAD1/5 tegengestelde signalen kan integreren en dat BMP9 signalering mogelijk ook gemedieerd kan worden door andere receptorcomplexen. Inderdaad, we tonen aan dat BMP9 signalering ook via ALK3 gemedieerd wordt en dat ALK3 neerregulatie in DLECs resulteert in verlaagde PROX1 waarden. Bovendien wordt ALK3 expressie gereguleerd door BMP9-ALK1 signalering op een SMAD1/5 afhankelijke manier. Over het algemeen kunnen we concluderen dat BMP signalering zeer complex verloopt in DLECs, waar BMP9 signalering tegengestelde effecten uitoefent op PROX1, via ALK1 en ALK3. We stellen een model voor dat de dualiteit van BMP signalering in DLECs aantoont. Dit model kan gebruikt worden voor verder onderzoek naar het belang van de BMP signaalweg in de ontwikkeling van lymfevaten, en mogelijke behandelingen van lymfevataandoeningen. Dit werk demonstreert de context afhankelijkheid van de BMP-SMAD signaalweg en toont ook het belang aan om diens interactie met andere signaalwegen te onderzoeken. Dit werk kan het veld een stap dichter brengen bij het begrijpen van de moleculaire regulatie van BMP signalering in lymfatisch endotheel.