De rol van lysosomaal Ca2+ in de regeling van autofagie

Het endoplasmatisch reticulum (ER) is het grootste organel in de cel en functioneert ook als de grootste Ca2+ opslag, met [Ca2+]ER rond 500 µM, terwijl [Ca2+]cyt rond 100 nM ligt. Verschillende eiwitten, waaronder de SERCA-pomp en de IP3 receptor, reguleren de Ca2+ inhoud van het ER. De hoge [Ca2+]ER is belangrijk voor de rol van Ca2+ als “secundaire boodschapper”, maar ook voor het goed functioneren van de ER-chaperonnes die betrokken zijn bij het vouwen van nieuw gesynthetiseerde eiwitten en het eiwit controlesysteem. Recent is naar voren gekomen dat de lysosomen ook Ca2+ opslagplaatsen zijn met [Ca2+]lys die ook rond 500 µM ligt. Om Ca2+ in de lysosomen te importeren, is een rol voorgesteld voor de Ca2+/H+ uitwisselaar terwijl verschillende Ca2+ exportkanalen, inclusief TRPML1 en TPC2, zijn beschreven.

Macroautofagie, of kortweg autofagie, is een proces dat altijd op een basaal niveau plaatsvindt om oude of slechtwerkende eiwitten en/of organellen af te breken en te hergebruiken. Vracht wordt opgenomen in een autofagosoom die uiteindelijk met een lysosoom fuseert, waar de afbraak plaatsvindt. Onder stressvolle omstandigheden kan het niveau van autofagie verhoogd worden om de cel te voorzien van nutriënten en energie. Zulke omstandigheden zijn bijvoorbeeld nutriënttekort, hypoxia, pathogeeninfectie en ER stress.

Ca2+ heeft een belangrijke rol in autofagie, en kan zowel remmend als stimulerend werken. Gematigde Ca2+ opname in de mitochondriën is nodig om de Krebs cyclus en energieproductie goed te laten werken, en remt zo autofagie. Verder zijn verschillende eiwitten die betrokken zijn bij autofagie afhankelijk van cytosolisch Ca2+. Tenslotte heeft het vrijlaten van Ca2+ uit de lysosomen een rol in bijvoorbeeld de fusie tussen autofagosoom en lysosoom, en zijn autofagie geïnduceerd door nutriëntarme omstandigheden, rapamycine of resveratrol afhankelijk van Ca2+.

Het ER is ook belangrijk voor eiwit- en vetsynthese. Wanneer de synthese en vouwing van eiwitten gehinderd wordt, accumuleren ongevouwen gevouwen of verkeerd gevouwen eiwitten in het ER-lumen. Om deze zogenaamde ER stress te verlichten en tegen te gaan, bevat het ER-sensoren die de ongevouwen eiwitrepons (OER) kunnen activeren. Deze respons bestaat uit drie armen, namelijk de IRE1α, de ATF6 en de PERK arm, die samen het overleven van de cel proberen te bevorderen door algemene eiwitsynthese te beperken en autofagie te bevorderen. Wanneer dit niet voldoende is om de ER stress op te lossen, zal de cel in apoptose gaan.

Hier hebben we onderzocht wat de rol van Ca2+ in ER stress-geïnduceerde autofagie is door gebruik te maken van de L-proline analoog L-azetidine-2-carboxylzuur (AZC). We hebben gevonden dat behandeling van HeLa cellen met 3 mM AZC gedurende 3-9 uur zowel de ATF6 als de PERK arm, maar niet de IRE1α arm, van de OER activeerde. Deze behandeling resulteerde ook in een verhoogde expressie van de ER-chaperonne BiP, maar de expressieniveaus van Erp57 of Erp72 waren niet veranderd. We laten verder ook zien dat AZC LC3-lipidatie induceert binnen 6 uur behandelingstijd, en dat dit afhankelijk was van PERK-activatie. Daarnaast zijn zowel PERK-activatie als LC3-lipidatie afhankelijk van cytosolisch Ca2+. Los hiervan, hebben we gevonden dat 6 uur voorbehandeling met AZC geen effect heeft op de Ca2+ inhoud van het ER, hoewel de toename van het cytosolisch Ca2+-niveau lager leek wanneer Ca2+ vrijlating uit het ER werd geïnduceerd. Bovendien werd het cytosol sneller weer vrijgemaakt van Ca2+ na vrijlating uit het ER, wat een verklaring is voor de geobserveerde lagere Ca2+ toename. De hogere snelheid waarmee het cytosol werd vrijgemaakt was niet afhankelijk van de expressieniveaus van de belangrijkste Ca2+ transporteurs IP3R, SERCA, PMCA of MCU, en was niet gerelateerd aan een veranderde Ca2+ opname in de mitochondriën.

Ten tweede hebben we onderzocht wat de rol van het lysosomale Ca2+ kanaal TRPML1 in autofagie is door gebruik te maken van de agonist MK6-83. We hebben gevonden dat 3 uur behandeling met 10 µM MK6-83 tot een sterke toename van LC3-II leidde onafhankelijk van inhibitie van mTOR, en we konden dit toeschrijven aan een specifiek effect van MK6-83 op TRPML1. Bovendien vond de LC3 lipidatie niet plaats wanneer MK6-83 werd gebruikt in combinatie met nutriëntarme omstandigheden, terwijl farmacologische inductie van autofagie met torin1 of resveratrol niet met MK6-83-geïnduceerde LC3-lipidatie interfereerde. Verder was de verlaging in het niveau van phospho-TFEB verdwenen wanneer MK6-83 gebruikt werd in combinatie met nutriëntarme omstandigheden, wat erop wijst dat er een mogelijk relatie bestaat tussen mTOR-inactiviteit, TFEB-activatie en LC3- lipidatie.

Samengevat, hebben we gevonden dat Ca2+ essentieel is voor AZC-geïnduceerde activatie van de PERK-arm van de OER en daaropvolgende LC3-lipidatie, en dat AZC een effect heeft op het vrijmaken van het Ca2+ in het cytosol nadat het vrijgelaten is uit de ER Ca2+ opslag. Daarnaast hebben we gevonden dat TRPML1 een hoge LC3-lipidatie induceert onafhankelijk van mTOR maar mogelijk wel afhankelijk van TFEB-activatie. Dit werd echter geremd door nutriëntarme omstandigheden, mogelijk vanwege een negatief feedbackmechanisme dat mTORC1 reactiveert.

Een beter begrip van de rol van Ca2+ in de OER en autofagie zou op termijn kunnen bijdragen aan verbeterde behandelingsstrategieën van bijvoorbeeld de ziekte van Alzheimer en mucolipidose type IV.