< Terug naar vorige pagina

Project

De rationale voor het herbestemmen van cidofovir om HPV positieve en negatieve epitheliale neoplasieën selectief te treffen

Humane papillomavirussen (HPVs) zijn dubbel strengige DNA virussen waarvan de mucosale alfa-types goedaardige (laag risico types) en kwaadaardige (hoog risico types) laesies kunnen veroorzaken. Hoog risico HPVs worden geassocieerd met baarmoederhalskanker, andere anogenitale kankers en een substantieel deel van hoofd- en halskankers (squameuze cel kankers) (HNSCC). Effectieve profylactische vaccins zijn beschikbaar maar worden voornamelijk toegediend aan jonge vrouwen terwijl oudere vrouwen en mannen ongevaccineerd blijven, ondanks de invoering van HPV vaccinatieprogramma’s voor mannen in verschillende landen. De huidige behandeling is gebaseerd op chirurgie, radio- en/of chemotherapie en is verantwoordelijk voor ernstige bijwerkingen. Tevens worden veel recidieven beschreven in de meest doorgedreven HPV ziekten. Daarom is de ontwikkeling van een selectieve behandeling, die in staat is om zowel bestaande HPV laesies terug te dringen als progressie van lichte vormen van de ziekte en recidieven te voorkomen, noodzakelijk.

Cidofovir (CDV) is een acyclisch nucleoside fosfonaat met antivirale activiteit tegen een breed spectrum DNA virussen. Er werd ook aangetoond dat CDV antiproliferatieve effecten heeft tegen verschillende HPV+ en HPV- cellijnen in vitro en in een muis xenograft model van HPV+ tumoren en in een katoenstaartkonijn PV model. CDV bleek actief te zijn in patiënten die aan verschillende goedaardige en kwaadaardige, ernstige HPV-geassocieerde ziekten leden, waaronder larynxpapillomatose, tandvlees en orale neoplasieën, verruca vulgaris, verruca plantaris, anogenitale laesies, hypo faryngale/oesofagale tumoren, anale intra-epitheliale neoplasie graad 1-3, vulvaire intra-epitheliale neoplasie graad 3 en cervicale intra-epitheliale neoplasie graad 2+ en 3. CDV bleek ook in vivo actief te zijn tegen HPV- maligniteiten waaronder glioblastoom, hemangiosarcoom en nasofaryngaal carcinoom.

Vooreerst trachtten we het selectief werkingsmechanisme van CDV tegen zowel HPV+ als HPV- getransformeerde cellen, in vergelijking met normale cellen, op te helderen. Ons laboratorium heeft voordien een volledig genoom genexpressie typering uitgevoerd met behulp van microarray’s in twee HPV+ baarmoederhalskankercellijnen, HPV- geïmmortaliseerde keratinocyten en normale keratinocyten. Deze data suggereerden activatie van celcyclusregulatie en dubbelstrengige DNA breuk (DSB) herstelmechanismen (‘ATM signalering’ en ‘DSB herstel met homologe recombinatie’) na CDV behandeling van normale cellen in tegenstelling tot HPV+ en HPV- getransformeerde cellen. Gebaseerd op deze bevindingen, vergeleken we HPV+ en HPV- baarmoederhalskanker -en HNSCC cellijnen met geïmortaliseerde keratinocyten (HaCaT) en normale cellen (primaire humane keratinocyten, primaire epitheliale cellen uit tonsillen en humane embryonale longfibroblasten) voor hun gevoeligheid voor CDV, geneesmiddel metabolisme, incorporatie van de actieve metaboliet in cellulair DNA en DNA-schade inductie (Hoofdstuk 2). Tumorcellen bleken meer gevoelig te zijn voor de antiproliferatieve effecten van CDV en incorporeerden meer CDV-difosfaat dan normale cellen. Om de inductie van DSB’s door CDV te bevestigen, werd ATM activatie getest in de verschillende celtypes. Een stijging in fosfo-ATM niveaus werd gedetecteerd na CDV blootstelling aan zowel tumorcellen als normale cellen. Detectie van γ-H2AX, een kwantitatieve merker van DSB’s, toonde een significante stijging in DSB’s in tumorcellen aan in vergelijking met normale cellen na CDV behandeling. De antiproliferatieve effecten van CDV waren gecorreleerd met incorporatie van de actieve metaboliet in het cellulair DNA, die gerelateerd was met de inductie van DNA-schade. Er werd echter geen correlatie geobserveerd tussen CDV geïnduceerde DNA-schade en zijn antiproliferatieve effecten, wat aantoont dat het werkingsmechanisme van CDV tegen kankercellen niet enkel kan toegeschreven worden aan DNA-schade. De effecten van CDV op celgroei, zijn incorporatie in DNA en DNA-schade waren niet gerelateerd aan het tumortype (i.e. afkomstig van baarmoederhals of hoofd- en hals weefsel) noch aan de HPV status. Gebaseerd op deze resultaten, werden eiwitten onderzocht die zich onder ATM in de homologe recombinatie DNA herstelcascade bevinden (p16, BRCA1, BRCA2 en RAD51) (Hoofdstuk 3). HPV+ en HPV- tumorcellijnen accumuleerden CDV-geïnduceerde DSB’s, wat werd afgeleid uit de accumulatie van RAD51 foci terwijl normale cellen in staat waren om RAD51 foci te ontbinden, dit bevestigt hun capaciteit om CDV geïnduceerde DSB’s te herstellen. De vorming van RAD51 foci was niet gerelateerd aan p16 expressie, waarop CDV geen impact had. Bovendien werd er geen verschil geobserveerd tussen HPV+ en HPV- cellijnen in de accumulatie van DSB’s. Deze resultaten suggereren dat de in vitro antikanker activiteit van CDV niet beperkt is tot HPV+ tumorcellen maar zou kunnen uitgebreid worden naar HPV- baarmoederhals -en HNSCC tumoren. Verdere studies die verschillende tumorcellijnen met verschillende genetische achtergrond includeren zijn echter vereist voordat CDV voorgesteld kan worden als een breedspectrum antikankermiddel.

In het tweede deel van deze doctoraatsthesis onderzochten we tumor-tumor interacties door gebruik te maken van een subcutaan xenograft model in naakte muizen zonder thymus waarbij de twee tumoren geen direct contact hadden. We evalueerden ook of intratumorale behandeling met CDV niet enkel een lokaal antitumor effect heeft, zoals reeds eerder aangetoond, maar ook een ver reikend effect dat zou leiden tot een vertraagde groei van de secundaire tumor (Hoofdstuk 4). Klinische data over tumor-tumor interacties binnen hetzelfde organisme bestaan voor verschillende kankers maar niet voor baarmoederhalskanker. We observeerden dat de aanwezigheid en de locatie van de primaire HPV+ xenograft geen impact had op de groei van de secundaire HPV+ tumor. CDV behandeling van een primaire xenograft had echter een tijdelijk ver reikend effect dat leidde tot een vertraagde groei van de secundaire tumor. Bovendien leidde volumereductie van de primaire tumor tot een verminderde mortaliteit en pathologie in muizen, aangetoond door vermindering van splenomegalie en inflammatie en toename van een antitumor immuunreactie. Het effect van CDV op de HPV+ xenograften is waarschijnlijk gemedieerd door een onrechtstreekse activatie van een antitumor immuunrespons en een vermindering van inflammatie. Aangezien het ver reikend effect van CDV van voorbijgaande aard was, onderzochten we het gebruik van apoptotische tumorcellen als bron voor een brede waaier aan tumor antigenen die in staat zijn om een meer integrale immuunrespons te induceren en gelijktijdige toediening van adjuvantia (aluminium hydroxide + monophosphoryl lipid A) en CDV in een poging om de immuunreactie te stimuleren om het ver reikend effect van CDV te verlengen en te verhogen (Hoofdstuk 4). Apoptotische tumorcellen waren niet in staat om de groei van een secundaire, subcutane tumor te vertragen. De adjuvantia op zich reduceerden de groei van zowel de primaire als de secundaire xenograft maar dit effect was niet synergistisch met CDV behandeling van de primaire xenograft.

Ter conclusie draagt deze doctoraatsthesis bij tot een beter inzicht in het selectief mechanisme van de antitumor activiteiten van CDV. Dit is cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën om HPV-geassocieerde neoplasieën te behandelen. Cidofovir is niet enkel in staat om het volume van een lokaal behandelde tumor te reduceren maar ook om inflammatie te verminderen en de immuunrespons in zulke zin te leiden dat het voordelig is voor de gastheer. Dit zijn belangrijke bevindingen met zicht op accumulerend bewijs dat aantoont dat het immuunsysteem een kritische rol speelt in het ontstaansproces van tumoren. Ons werk bouwt een basis voor verder onderzoek naar CDV als een DNA-schade inducerend middel tegen zowel HPV+ als HPV- tumoren en voor het potentieel van combinatietherapie alsook voor de ontwikkeling van verbeterde farmacologische formuleringen van CDV.

 

 

Datum:5 aug 2013 →  23 mrt 2018
Trefwoorden:Cidofovir, Human papillomavirus, DNA damage
Disciplines:Microbiologie, Systeembiologie, Laboratoriumgeneeskunde
Project type:PhD project