De ontwikkeling van een biomimetisch celgebaseerd construct voor osteochondrale regeneratie met behulp van 3D-bioprinttechnologie

De uiteinden van botten, die samenkomen in een gewricht, zijn bedekt met kraakbeen, een zeer gespecialiseerd weefsel dat de epifysen beschermt tegen de wrijvings- en compressiekrachten, die in een gewricht worden uitgeoefend. Het kraakbeen aan het gewrichtsoppervlak kan beschadigd raken door acute letsels, ziekte of chronische aandoeningen. Helaas heeft het gewrichtskraakbeen een beperkt genezingspotentieel en defecten in het gewrichtsoppervlak kunnen uitbreiden tot in het  subchondrale bot. De resulterende osteochondrale defecten veroorzaken pijn en mobiliteitsbeperking voor de patiënt, en wanneer ze onbehandeld blijven, kan verdere schade aan het gewrichtskraakbeen, posttraumatische osteoartritis en vervorming van het subchondrale bot optreden. Behandelingen zoals gewrichtsdebridement en microfractuur richten zich op tijdelijke verlichting van de symptomen en zullen doorgaans resulteren in de vorming van mechanisch inferieur fibreus kraakbeen. De aanwezigheid van fibreus kraakbeen is een risicofactor voor osteoarthritis, en in ernstige gevallen van osteoarthritis is een knieprothese vereist. Omdat protheses echter een beperkte levensduur hebben, zijn ze geen goede oplossing voor jongere patiënten. Daarom is het belangrijk dat osteochondrale defecten worden behandeld en dat het kraakbeen aan het gewrichtsoppervlak wordt hersteld. De huidige restauratieve behandelingen voor diepe osteochondrale defecten impliceren de transplantatie van gezonde osteochondrale weefselpluggen van een donor of van een niet-belaste regio van het gewricht. Aangezien gezond weefsel niet altijd beschikbaar is en er risico's zijn zoals morbiditeit op de plaats waar de weefselplug genomen werd, worden alternatieve behandelstrategieën onderzocht.

‘Tissue engineering’ heeft tot doel een duurzame strategie te ontwikkelen om functioneel weefsel te regenereren en secundaire schade, zoals veroorzaakt door grote transplantaten, te vermijden. Bij celgebaseerde benaderingen wordt een implantaat met allogene of autologe weefselvormende cellen in het gewrichtsdefect geplaatst. Het incorporeren van biomaterialen, en hydrogels in het bijzonder, als een ondersteunende matrix voor de weefselvormende cellen kan de weefselvorming verbeteren en maakt een gemakkelijke hantering van het implantaat mogelijk. Bovendien maken implantaten op basis van cellen in hydrogel gecontroleerde celdistributie mogelijk en zijn ze geschikt voor verschillende procestechnieken, waaronder geautomatiseerde fabricage.

Onze strategie in deze doctoraatsstudie was om krachtige matrixvormende cellen te incorporeren in een biocompatibele hydrogel. Gelatine methacryloyl (GelMA) is een semi-synthetische hydrogel op basis van gehydrolyseerd collageen. GelMA is gebaseerd op een natuurlijk polymeer, met eigenschappen vergelijkbaar met de oorspronkelijke extracellulaire matrix, waardoor biocompatibiliteit en biologische afbreekbaarheid worden gegarandeerd, in combinatie met de voordelen van een synthetische hydrogel waarvan de mechanische eigenschappen aangepast kunnen worden. Tissue engineering van gewrichtskraakbeen gebeurt idealiter met articulaire chondrocyten. Maar, het verkrijgen van de vereiste hoeveelheid gezonde articulaire chondrocyten is een uitdaging vanwege het ontbreken van gezonde chondrocyten in een aangetast gewricht en dedifferentiatie bij expansie in vitro. De oplossing die we hier voorstellen, is het gebruik van iPSC-afgeleide chondrocyten, i.e. chondrocyten verkregen uit de differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). iPSC's zijn somatische cellen die zijn geherprogrammeerd tot hun pluripotente staat. Deze cellen vertonen een beperkte immunogeniciteit en kunnen vóór differentiatie worden geëxpandeerd, waardoor grote aantallen functionele chondrocyten kunnen verkregen worden.

Ten eerste werden verschillende celdichtheden vergeleken en de matrixvorming van iPSC-afgeleide chondrocyten in GelMA werd geëvalueerd. We toonden aan dat de cellen in staat waren om kraakbeenachtige matrix te produceren, met een hoge expressie van chondrogene markers. Vervolgens werden deze implantaten in vivo in een ectopische setting geëvalueerd, zowel met als zonder in vitro matrixvorming voorafgaand aan implantatie. We ontdekten dat implantaten die reeds matrixvorming hadden vóór implantatie, subcutaan kraakbeen genereerden na 4 weken in vivo in naakte muizen. Implantaten zonder matrixvorming voor implantatie waren ook in staat om in vivo een kraakbeenachtige matrix te genereren, zij het minder matuur. Om de overgang te maken tussen het verkregen kraakbeen en het subchondrale bot aan de onderkant van het defect, gebruikten we multipotente periosteum-afgeleide cellen (hPDC's). Deze cellen spelen een belangrijke rol bij de botontwikkeling en bij de genezing van breuken. We testten hPDC's in GelMA in een serumvrij differentiatiemedium en ontdekten dat de kraakbeenachtige matrix die in vitro gevormd wordt, in vivo endochondrale ossificatie ondergaat. Na 4 weken werd ectopisch gemineraliseerd kraakbeen en corticaal bot gevormd. Met het doel om de iPSC-afgeleide chondrocyten en hPDC’s in een duaal implantaat te gebruiken, herhaalden we de experimenten met iPSC-afgeleide chondrocyten in hetzelfde serumvrije differentiatiemedium. We stelden vast dat de iPSC-afgeleide chondrocyten ook in deze mediumcondities in staat waren om in vivo kraakbeenmatrix te vormen, waarbij de maturiteit van het weefsel afhing van de lengte van de in vitro kweek. Ten slotte evalueerden we de combinatie van iPSC-afgeleide chondrocyten- en hPDC’s in GelMA hydrogel in vivo in een orthotopische setting in osteochondrale defecten in het kniegewricht van naakte ratten. Dit leverde een proof-of-concept van weefselregeneratie door beide celtypes in GelMA hydrogel. Er was echter ruimte voor verbetering op het gebied van integratie, onder andere door beperkingen van de fabricatiemethode van de implantaten. Als vervolgstudie werden de twee celtypes in GelMA hydrogel gebruikt als biologische inkt in een extrusie-gebaseerde bioprint-opstelling, om de haalbaarheid van geautomatiseerde fabricatie van dubbele implantaten te onderzoeken. We concludeerden dat, volgens onze in vitro-onderzoeken, individuele iPSC-afgeleide chondrocyten en hPDC's in GelMA biologisch functioneel waren na bioprinten en konden worden getest in een orthotopische omgeving.

Samengevat demonstreerden we het potentieel van individuele cellen in een biocompatibele en bioprintbare hydrogel voor kraakbeen- en osteochondrale weefselregeneratie. Deze aanpak is in vitro en in vivo geëvalueerd in kleine diermodellen, wat het potentieel van deze strategie aantoont om implantaten te fabriceren voor de behandeling van defecten aan het gewrichtsoppervlak.