De mega-enzymen niet-ribosomale peptide synthetases / polyketide syntheses gecodeerd in melkzuurbacteriën

            Verwerving van een reeks functionele genen, stelde de stam Lactobacillus plantarum WCFS1 in staat zich aan te passen aan diverse niches zoals zuivelproducten en de menselijke maagdarmstelsel. De lactis-specifieke genen, anderzijds lieten het toe dat Lactococcuslactis KF147 zich aanpaste aan de plant niche. De beide melkzuurbacteriën (LAB) spelen een positieve rol in humane voeding en gezondheid, net als andere bekende probiotica. Voor het eerst werd in melkzuurbacterien, een nieuwe niet-ribosomale peptide synthetase (NRPS) en een hybride niet-ribosomale peptide synthetase-polyketide synthase (hybride NRPS-PKS) ontdekt in het genoom. De zoektocht naar homologen leidden tot identificatie van het nieuwe NRPS van Lactobacillus plantarum WCFS1 met gelijkaardige module en domeinbeheer organisatie in negen andere stammen van Lactobacillus plantarum, namelijk RI-515, PS128, B21, K35, P86, P67, P26, TMW 1.708 en 19.1, twee stamen van Clostridium (Clostridiumsp. DMHC 10 and Clostridiumakagii DSM 12554), Carnobacteriuminhibens subsp. Inhibens DSM 13024 K1, zes stamen van Enterococcus (Enterococcusdevriesei DSM 22802, Enterococcus sp. KPPR-6, Enterococcusthailandicus DSM 21767, Enterococcusfaecium KACC16100, Enterococcusfaecium E2039 en Enterococcus faecium KACC16106) and vier stamen van Streptococcus (Streptococcus sp. HMSC034F02, Streptococcus sp. HMSC034B04, Streptococcusoralis subsp. Tigurinus AZ_3a en Streptococcusanginosus isolate BVI). Anderzijds, werden identieke hybridesystemen met soortgelijke gen module en domeinorganisatie ook gevonden in zes andere Lactococcus lactis stammen (KF134, NCDO 2118, KF196, Li-1, KF146 en YF11), en vijfentwintig stammen van de tandpathogeen Streptococcus mutans.     De NRPS en PKS mega-enzymen bestaan uit meerdere functionele domeinen die samen meerdere modulen vormen die secundaire metabolieten synthetiseren (ook bekend als natuurlijke producten). Normaalgesproken, vertonen de natuurlijke produkten vele belangrijke biologische activiteiten en goede farmaceutische eigenschappen (zoals antibiotica, anti-kanker en immuun-onderdrukkende middelen) en zijn succesvol gebruikt in geneesmiddelenindustrie.

            In deze studie was het doel om deze twee mega-enzymen die zijn gecodeerd in de twee melkzuurbacterien te karakteriseren. Voor dit doel werd een nieuwe strategie toegepast, uitgebreide bioinformatica benaderingen werden gebruikt om de NRPS en de hybride NRPS-PKS metabole routes in respectievelijk Lactobacillus plantarum WCFS1 en Lactococcus lactis KF147 en hun homologe systemen te karakteriseren. De aanpak bevatte het analyseren van 140 microbiële genomen die NRPS / PKS-systemen bevatten, met behulp van Hidden Markov Model profielen van alle kerndomeinen. Er werden tal van systemen gevonden. Verschillende genomen bleken drie of meer systemen inclusief hybride systemen te coderen, voornamelijk microorganismen met genomen groter dan 4 MB, geïsoleerd uit grond of aquatisch milieu.

            Als hoofdstap in het karakteriseren, werd de mogelijkheid om substraatspecificiteit van de adenylatie (A) en acyltransferase (AT) domeinen van de NRPS en PKS systemen, respectievelijk, die de bouwstenen herkennen identificeren, aangewend voor de snelle ontdekking of ontwerp van nieuwe producten van deze systemen. In deze richting konden we een efficiënt generiek instrument om de substraat specificiteit van de A en AT-domeinen te herkennen ontwikkelen, met behulp Ensembles van Substraat Specifieke Hidden Markov Models (ESSHMM). De ensemble voorspeller is in een eenvoudige web-based tool die beschikbaar is op http://www.cmbi.ru.nl/NRPS-PKS-substrate-predictor/.

            De meest recente en accurate tools, waren slechts in staat om de substraatspecificiteit van drie van de zes adenylatiedomeinen van het NRPS system van Lactobacillus plantarum WCFS1 en homologen te voorspellen. Dit bevestigt dat deze systemen nog niet eerder ontdekt warden. De voorspelde substraatspecificiteit van de zes A-domeinen en de iteratieve trans-AT domeinen werd gebruikt om de primaire structuur te voorspellen van het natuurlijke product dat mogelijk geproduceerd wordt door het hybride NRPS-PKS systeem van Lactococcus lactis KF147 en homologen (Leu-DLeu-Asp-DAsn-Gly-MC-MC-MC-DAsp).

            Regulering van de twee systemen en hun homologen werd bestudeerd om te helpen bij het verder karakteriseren. De bevindingen suggereren dat de NRPS van Lactobacillus plantarum WCFS1 en de identieke systemen in de andere stammen hoogstwaarschijnlijk worden gereguleerd als een geheel gen operon met hun geconserveerde upstream PTS systemen door σ54 factoren. In verband met de regulering van de hybride NRPS-PKS van Lactococcus lactis KF147 en de homologe systemen in de Streptococcus mutans stammen, veronderstellen de regulerende functies dat zij worden gereguleerd door het sterk geconserveerde twee-componenten systeem aanwezig stroomopwaarts van de NRPS-PKS-gen operons. Verder leidden de bevindingen tot de aanname dat het twee-componentensysteem signalen overbrengt voor biologische celreacties op een hybride metaboliet (NRP-PK) productie en biofilmvorming en oxidatieve stress resistentie veroorzaken.

            De nieuwe techniek voor de erkenning van specificiteit en de gevolgde benadering strategie kan worden gebruikt om andere nieuwe ontdekte NRPS / PKS systemen te karakteriseren, die aanzienlijk zijn toegenomen als gevolg van genoom-mining benaderingen. In conclusie vonden we een nieuwe NRPS en hybride NRPS-PKS-systeem gecodeerd door Lactobacillus plantarum WCFS1 en Lactococcus lactis KF147 en vonden wij dat deze en hun homologen natuurlijke producten produceren met nieuwe chemische structuren.