De invloed van mycorrhizae op de ruimtelijke verspreiding van terrestrische orchideeën

Orchideeën zijn lange tijd beschouwd geweest als een wetenschappelijke buitenissigheid en zelfs  Charles Darwin was geïntrigeerd door hun merkwaardige levensstijl. Hij merkte op dat ‘de zaden in grote hoeveelheden geproduceerd worden... Maar wat een onbeperkte vermenigvuldiging van orchideeën op aarde tegenhoudt, is niet gekend.’ (Darwin (1877). Vandaag weten we dat een overvloedige zaadproductie en de lage kieming en vestiging van kiemplanten het gevolg zijn van een verplichte associatie met compatibele schimmels. Desondanks weten we slechts weinig over de relaties tussen schimmels en orchideeën. Over welke schimmels gaat het hier juist? Waar komen deze voor? Hoe specifiek zijn de relaties tussen orchideeën en schimmels? En wat is de impact van orchidee-schimmel interacties op de kieming, vestiging van kiemplanten en dus de ruimtelijke verspreiding van orchideeën?

De allesomvattende doelstelling van deze doctoraatsthesis bestaat erin om nieuwe methodologische ontwikkelingen in high-throughput sequencing en andere op DNA gebaseerde methoden te testen en toe te passen om een antwoord te geven op hogergestelde vragen en om meer en betere inzichten te verwerven in de manier waarop associaties met schimmels de ruimtelijke verspreiding van orchideeën bepalen.

In hoofdstuk twee werd de geschiktheid van verschillende combinaties van bestaande PCR primers nagegaan om op de meeste efficiënte en nauwkeurige wijze de gemeenschappen van schimmels die met orchideeën associëren te karakteriseren op basis van 454 amplicon pyrosequencing. Hiertoe werden zowel een artifiële schimmelgemeenschap gebruikt alsook natuurlijke schimmelgmeenschappen die teruggevonden worden op de wortels van drie orchideesoorten, Anacamptis morio, Ophrys tenthredinifera en Serapias lingua. Onze resultaten gaven weer dat de primerparen ITS3/ITS4OF en ITS86F/ITS4 beter scoorden dan alle andere primerparen die getest werden, zowel wat betreft het totaal aantal sequenties, het aantal operationele taxonomische eenheden (OTUs) als het totaal aantal schimmelfamilies die gedetecteerd werden in orchideeënwortels. Daarnaast bleek dat de twee primerparen grotendeels complementair waren en andere schimmels oppikten, waardoor ze uitermate geschikt zijn om ze naast elkaar te gebruiken om zo goed mogelijk de volledige schimmeldiversiteit in orchideewortels te karakteriseren.

In hoofdstuk drie werden kiemingsexperimenten gecombineerd met bodemanalyses en onderzoek naar schimmelgemeenschappen op basis van 454 amplicon pyrosequencing om het relatieve belang van zaadverbreiding, de beschikbaarheid van schimmels in de bodem en lokale groeicondities op de ruimtelijke verspreiding van de Groenknolorchis (Liparis loeselii) na te gaan. Hoewel deze soort een ruim verspreidingsgebied kent, is ze in Europa uiterst zeldzaam gewroden en in bepaalde gebieden is ze zelfs bedreigd. Onze resultaten gaven weer dat de schimmelgemeenschappen die associëren met L. loeselii sterk verschilden tussen groeiplaatsen en levensfases van de plant, maar dat deze verschillen de kieming niet beïnvloedden. Kieming vond plaats onafhankelijk van het feit of de soort op een groeiplaats voorkwam of niet, en werd vooral bepaald door het vochtgehalte van de bodem. Deze resultaten geven weer dat de Groenknolorchis geen specifieke vereisten stelt wat betreft schimmels die kieming induceren en dus op opportunistische wijze associaties aangaat met schimmels die vrij beschikbaar zijn in de bodem. Verder toonden onze resultaten aan dat de beschikbaarheid van schimmels niet noodzakelijk de drijvende factor is die de ruimtelijke verspreiding van orchideeën beïnvloedt. 

In hoofdstuk vier werd op basis van 454 amplicon pyrosequencing ruimtelijke variatie in de gemeenschap van potentieel geschikte orchideeschimmels onderzocht in de wortels van drie samen voorkomende orchideeën, Anacamptis morio, Gymnadenia conopsea en Orchis mascula. Tevens werd nagegaan hoe schimmelgemeenschappen veranderden in de bodem. Alle analyses werden uitgevoerd in een soortenrijk kalkgrasland in het zuiden van België. Onze resultaten toonden aan dat vermeende orchideeschimmels wijd verpreid in de bodem voorkwamen, hoewel verschillen in gemeenschapssamenstelling sterk konden gerelateerd worden aan de identiteit van de gastheerplant. De diversiteit en frequentie van sequenties die overeenkomen met orchideeschimmels nam daarbij sterk af met toenemende afstand van de soort. Deze resultaten suggereren dat het sterk geclusterde voorkomen van orchideeën tot op zekere hoogte bepaald wordt door de sterk gelokaliseerde verspreiding van soort-specifieke orchideeschimmels.

In hoofdstuk vijf werd de abundantie en verspreiding van orchideeschimmels in de bodem meticuleus onderzocht en werd nagegaan hoe deze de vestiging van kiemplanten van twee gerelateerde orchideesoorten (Orchis mascula en Orchis purpurea) beïnvloedden. Om dit te onderzoeken bepaalden we eerst ruimtelijke variatie in de abundantie van de belangrijkste schimmels in de bodem op basis van kwantitatieve PCR (qPCR) en voerden we ruimtelijke puntpatroon analyses uit op basis van lange-termijn demografische data en cluster punt procesmodellen. De qPCR analyses gaven weer dat de abundantie van de schimmels sterk afnam met toenemende afstand van adulte planten. De ruimtelijke puntpatroon analyses gaven weer dat vestiging van kiemplanten niet willekeurig gebeurde, maar meestal plaatsvond in de onmiddellijke nabijheid van adulte planten. Wanneer beide resultaten gecombineerd werden, bleek dat de afname in schimmelabundantie bijna perfect samenviel met de kans op kiemplantrecrutering. Deze resultaten geven dus weer dat de verspreiding en abundantie van orchideeschimmels een bepalende invloed uitoefenen op de bovengrondse verspreiding van orchideeën.  

In het laatste hoofdstuk worden de belangrijkste resultaten van dit onderzoek nog eens overlopen. Tevens worden vorderingen van lopend onderzoek in verband met de recenste ontwikkelingen in sequencing technologie beschreven en worden de implicaties van dit onderzoek voor toekomstige experimenten besproken. Tot slot worden enkele tekortkomingen van het onderzoek aangehaald en suggesties gegeven voor toekomstig onderzoek.