< Terug naar vorige pagina

Project

De hepatische progenitor cel niche: onder experimentele condities en in humane leverziekten

De hepatische progenitor cellen (HPCs) zijn de stamcel-achtige cellen van de lever. Ze zijn klein, situeren zich in de kanalen van Hering en worden gekarakteriseerd door een relatief grote, ovale nucleus en weinig cytoplasma. HPCs brengen zowel merkers van (immature) hepatocyten (zoals alfa-fetoproteïne) tot expressie als merkers van cholangiocyten (zoals cytokeratine K7 en K19) en kunnen differentiëren in cholangiocyten of hepatocyten. Niettemin zijn de mechanismen achter de proliferatie en differentiatie van humane HPCs nog steeds niet goed gekend. Meer kennis is nodig om de potentiële therapeutische mogelijkheden van HPCs in chronische leverziekten en in leverkanker te identificeren.

Het doel van dit project was om HPCs en hun niche in humane leveraandoeningen te bestuderen met de focus op het begrijpen van activatie- en differentiatieprocessen van deze cellen in humaan leverfalen en hun rol in carcinogenese.

Het grootste deel van dit proefschrift omvatte de isolatie van HPC-verrijkte cel populaties uit adult, humaan leverweefsel door gebruik te maken van verschillende isolatiemethoden en deze populaties te vergelijken op zowel proteïne als RNA niveau. We verzamelden vers humaan leverweefsel van alcoholisch steatohepatitis (ASH) explant levers en isoleerden de HPC-verrijkte populaties via drie verschillende methoden. De ‘Side Population’ (SP) methode is gebaseerd op de progenitor cel efflux capaciteit van de fluorescente, DNA-bindende kleurstof Hoechst-33342. De expressie van EpCAM en TROP-2, 2 membraanmerkers, werd geëvalueerd in de alcoholische leverstalen en hun capaciteit getest om de HPCs te isoleren. Vergelijking van de expressie van TROP-2 en EpCAM met de expressie van K19, een gekende en gevalideerde HPC merker, toonde een gelijkaardig patroon aan en dus expressie op de membranen van HPCs. Via fluorescentie geactiveerde cel sorteringsmethode (FACS) isoleerden we de SP, EpCAM+ en TROP-2+ populaties. Merker analyse toonden we een verrijking van HPCs aan in de geïsoleerde populaties en de relatieve afwezigheid van andere celtypes. Vergelijking van deze HPC-verrijkte populaties met extracten van volledige lever en het uitvoeren van pathway analyse na high-throughput RNA sequentiebepaling, legde de verrijking en activatie van HPC pathways bloot bekend van onderzoek van diermodellen zoals Wnt/beta-catenine, HGF, FGF an TWEAK signaaltransductie. Signalen zoals TWEAK en FGF7, induceren deze signaaltransductie in HPCs en kunnen gevonden in de dichte nabijheid van deze cellen zoals aangetoond bij de isolatie van HPCs en hun niche met behulp van ‘laser capture microdissection’ (LMD). Bovendien toonde analyse van de verschillende HPC-verrijkte groepen potentiële nieuwe ‘upstream’ regulatoren aan zoals de cytokinines en groeifactoren TNFα, PDGFB, VEGFA, MIF en IGF-1. Deze factoren werden nog niet eerder gelinkt met HPCs maar zijn wel beschreven in relatie tot het behouden van stamcel eigenschappen, overleving van de cel en zelf-vernieuwing van mesenchymale stamcellen. Verdere pathway analyse duidde het mogelijke belang aan van IL-17A signaaltransductie voor HPCs en leveraandoeningen. Samen met de expressie van immuuncel-chemoattractant genen door HPCs suggereren deze gegevens dat HPCs een actieve bijdrage kunnen leveren aan leverinflammatie.

In een ander deel van dit proefschrift, richtten we ons op het karakteriseren van kankerstamcel (CSC) niche in verschillende subtypes van hepatocellulaire carcinoma’s. We isoleerden de SP van K19-negatieve, K19-positieve en gemengde fentotypes van humane hepatocellulaire carcinoma’s. De grootte van de SP correleerde met de graad van HPC kenmerken van de tumoren en toonde een verhoogde expressie van HPC merkers aan. De gedetecteerde verhoogde expressie van de extracellulaire matrix merker LAMC2, coderend voor de laminine γ2-keten, kon gelinkt worden met een verhoogde expressie van K19, verhoogde chemoresistentie en gereduceerde tumorgroei. Dit werd gedemonstreerd zowel in vitro als in vivo.

In conclusie, we voerden de eerste RNA sequentiebepaling gebaseerde, vergelijkende transcriptoom analyse uit van geïsoleerde humane HPCs van ASH patiënten en toonden actieve signaaltransductie aan tussen HPCs en hun naburige niche cellen, suggererend dat HPCs een actieve rol kunnen spelen in leverinflammatie. Toch blijven in vitro/in vivo functionele assays nodig om deze hypothese te onderbouwen. We identificeerden ook een prominente rol voor laminine-332 als onderdeel van de gespecialiseerde CSC niche in het behouden en ondersteunen van stamceleigenschappen, die leiden tot chemoresistentie en quiescentie van levertumoren.

Datum:1 sep 2013  →  1 sep 2017
Trefwoorden:Hepatic progenitor cells, Cell isolation, proteomics
Disciplines:Laboratoriumgeneeskunde, Morfologische wetenschappen
Project type:PhD project