De functionele evolutie van MADS-box genen aangedreven door genduplicatie en mRNA-gebonden proteomen in planten.

Samenvatting

Tijdes mijn gehele PhD carrière, was het onderzoek naar de impact van de geheel-genoomduplicatie op de functionele innovatie van genen een belangrijke focus. Er werden twee eiwit-eiwit interactie netwerken van voorouderlijke MADS-domeineiwitten (MADS-domein PINs) gereconstrueerd met gebruik van fylogenetische en biochemische methoden. Eén netwerk werd gereconstrueerd net vóór een voorouderlijke volledige genoom triplicatie (γ triplicatie) die gebeurde aan de oorsprong van de kerneudicots, de grootste groep van bloemplanten. Het tweede netwerk werd gereconstrueerd na de γ triplicatie en aan de splitsing van de Asteriden en Rosiden. Ter vergelijking werden ook de bestaande MADS-domein PINs in Arabidopsis thaliana en Solanum lycopersicum gereconstrueerd, ieder een model plant voor respectievelijk van Rosiden en Asteriden. De gekozen MADS-box gensubfamilies zijn kritische regulatoren van de reproductieve ontwikkeling van planten en de γ triplicatie werd lang aanzien als de hoofdkracht voor het aandrijven van de divergentie van de kerneudicots. Doorheen de directe vergelijking tussen voorouderlijke en bestaande netwerken ontdekken we een aantal innovaties aangedreven door de γ triplicatie op het netwerkniveau. De γ triplicatie genereerde een drastisch nieuw netwerk dat sterk gerewired werd door de toevoeging van veel nieuwe interacties. Deze nieuwe interacties toonden nieuwe redundantie aan tussen paraloge eiwitten en een nieuwe bindingspartner. Simulaties tonen aan dat zowel de additie van knopen en verbindingen in het netwerk doorheen de γ triplicatie belangrijk waren om de modulariteit in het network te behouden. Preferential attachment was enkel observeerbaar in geconserveerde interacties door de γ triplicatie en werd niet waargenomen toegevoegde interacties. Doorheen netwerkevolutie verliezen de hubs voortdurend meer interacties. Wegens de constante netwerkdichtheid werden deze verloren interacties van hubs opnieuw toegevoegd aan knopen met weinig verbindingen. De hubs worden meer specifiek doorheen evolutie en was het onderliggende mechanisme achter de waargenomen netwerk rewiring. Een aantal kritische MADS-domein eiwitcomplexen met nieuwe eiwit interacties ontstonden bovendien door de γ triplicatie en zijn hoofdzakelijk betrokken zijn bij de regulatie van de ontwikkeling van bloeiwijzen en bloemorganen gerelateerd met de verhoogde robuustheid van de bloemontwikkeling in kerneudicots of Pentapetalae.    

Tijdens het tweede en derde jaar van het doctoraat, was ik ook betrokken bij een interessante deel over waarbij de experimenten werden ontworpen door Dr. Philip Ruelens. De plotselinge verschijning van angiospermen (bedektzadigen of bloemplanten) ongeveer 130 miljoen jaar geleden werd gezien door Charles Darwin als een “abominable mystery”. De gymnospermen (naaktzadigen), die het dichtst verwant zijn met de angiospermen, zijn morfologisch verschillend van de bloemplanten. De bloemen van angiospermen zijn tweeslachtig terwijl de voortplantingsorganen van gymnospermen apart ontwikkelen. Vanwege de grote morfologische verschillen tussen gymnospermen en angiospermen en het ontbreken van de fossiele records voor de overgangse plantsoorten, is de oorsprong van de bloem in angionspermen niet goed begrepen. Maar één oplossing voor het begrijpen van deze overgang in de evolutie kan wel plaatsvinden op de evolutie van sommige regulatorische type II MADS-box gensubfamilies (voornamelijke B-, C/D- en E-klasgenen), die fylogenetisch verwant zijn tussen gymnospermen en angiopermen. MADS-box genen coderen voor transcriptie factoren met een sterk geconserveerde DNA-bindende domein (MADS-domein). In de afgelopen twee decennia hebben studies aangetoond dat de verschillende combinatie van deze transcriptiefactoren de identificatie van de mannelijke en vrouwelijke voortplantingsorganen bepaalt in gymnospermen en angiospermen door de vorming van kwartet complexen en de fysieke binding aan cis-regulatorische CArG boxen van hun targetgenen. Dergelijke kwartet complexen zijn ook bekend als “bloemkwartets” in bloemplanten. Door het reconstrueren van de voorouderlijke MADS-domein eiwitten van B-, C/D- en E-klasse genen kunnen we daarom de evolutie van “bloemkwartets” traceren vóór de oorsprong van de bloemplanten. Onze studies tonen aan dat net vóór de oorsprong van de bloemplanten verandering in samenstelling is opgetreden van de voorouderlijke complexen. Van twee subeenheden via genduplicatie naar de vier typische subeenheden met de integratie van SEPALLATA eiwitten in het bloemkwartet dat de mannelijke orgaan identiteit specificeert. De veranderingen van de eiwitinteracties veroorzaakt door deze verandering in samenstelling was het resultaat van een geleidelijk en omgekeerd evolutionair traject. Het simulatiemodel toont aan dat de compositionele shifts de evolutie van de tweeslachtige bloem kan verklaren. De resultaten in onze studie voorzien nieuwe inzichten in de manier waarop de bloemkwartets evolueren vóór de opkomst van de angiospermen wat zou kunnen leiden tot een beter begrip van de oorprong van bloemen.

Ik heb ook deelgenomen aan een andere studie om te begrijpen hoe de eigenschappen van SEPALLATA3 (AtSEP3), een eiwit met hub en lijm eigenschappen in Arabidopsis, ontstonden en zijn geëvolueerd in een netwerk van eiwit interacties met gebruik van gereconstrueerd voorouderlijke en bestaande MADS-domein transcriptiefactoren. Na γ triplicatie werden veel nieuwe eiwitinteracties gemedieerd. Door het omwisselen van SEP3 en zijn voorouders in de netwerken van verschillende leeftijd werd er ontdekt dat het eiwit de capaciteit van gemeenschappelijke interacties verliest en specificiteit verkrijgt. Dit komt overeen met de beperkingen van de conformaties door de accumulatie van de proline residus in de linkerregio tussen domeinen die mindere flexibiliteit van het eiwit maakt. Dit suggereert dat de eiwitten gericht kunnen evolueren naar een verhoogde specificiteit met verminderde flexibiliteit waarbij de complexiteit van het eiwitinteractienetwerk specificiteit vereist.

Tijdens het laatste twee jaar van mijn PhD heb ik me toegelegd op de studie van de bio-moleculaire interactie tussen RNA en eiwitten. In de moleculaire biologie is de complexiteit van RNA regulatie één van de huidige grenzen van het moleculair biologisch onderzoek. RNA-bindende eiwitten (RBPs) zijn typische eiwitten betrokken bij post-transcriptionele genregulatie (PTGR) door de interactie met RNA. In planten, b.v. in het Arabidopsis genoom zijn er meer dan 200 RBPgenen voorspeld gebaseerd op goed-gedefinieerde sequentiemotieven. In vergelijking met recente studies van dierlijke RBPs blijft het experimentele bewijs voor de meeste voorspelde plant RBPs nog beperkt. Het mRNA-gebonden proteoom van dierlijke cellijnen werd recent gecatalogiseerd met succes met behulp van een nieuwe methode genoemd interactome capture. Deze methode berust op in vivo UV crosslinking van eiwitten op RNA, de opzuivering van mRNA met gebruik van complementaire oligo(dT) parels en de identificatie van de gecrosslinkte eiwitten met gebruik van massa spectrometrie. We beschrijven hoofdzakelijk een geoptimaliseerd systeem van mRNA interactome capture voor Arabidopsis thaliana en Brachypodium distachyon bladmesofylprotoplasten, een celtype vaak gebruikt in de functionele cellulaire assays. We stellen de condities voor de optimale eiwitopbrengst vast en tonen het hoge rendement van geoptimaliseerde interactome capture voor plantcellen aan. In het mRNA-gebonden proteoom van bladmesophylprotoplast werd bovendien voor de eerste keer een aantal kandidaat RBPs (niet-klassieke RBPs) in planten gevonden. Dit experimenteel bewijs zal bijdragen tot het ontrafelen van de specifieke functies van deze kandidaat RBPs betrokken in de regulatie van mRNAs.