Conformationele dynamiek in de Sec secretieweg

Eiwit biogenese is een complex proces dat voorkomt bij proteïnes met een functie in extracytoplasmatische cellulaire compartimenten, of daarbuiten. Deze proteïnes vertegenwoordigen meer dan één derde van elk proteoom. Hun opvouwing is tijdelijk en plaatselijk losgekoppeld van de eiwittranslatie. Bovendien is het noodzakelijk dat deze proteïnen naar de export machines worden gericht en door deze getransloceerd worden. De meeste geëxporteerde eiwitten passeren hierbij langs het ubiquitair Sec secretie systeem in een slecht gekarakteriseerde ontvouwen staat. Hoewel membraaneiwitten co-translationeel geëxporteerd worden in bacteriën, volgen secretoire proteïnes vooral een post-translationele route, dewelke het onderwerp is van deze studie.

Eens het gewenste cellulaire compartiment bereikt is vouwen de eiwitten op tot hun natieve conformatie. Sec-afhankelijke export hangt af van zowel niet-natieve conformaties als specifieke en functionele herkenning van het substraat om ongeoorloofde export te voorkomen.

Tot nu toe werd het overkomen van deze uitdagingen toegekend aan signaal peptiden die zich bevinden aan de amino-terminus van het mature domein van de geëxporteerde proteïnes tijdens de verplaatsing van het ribosoom naar het membraan, alsook door chaperones. Signaal peptiden voorzien het eiwit van het richtende signaal, stellen het opvouwen van het proteïne uit, en activeren het export kanaal, terwijl chaperones de rol van “holdases” spelen en opvouwing en aggregatie voorkomen. Desalniettemin zijn signaal peptiden en chaperones overbodig voor het richten en de daarop volgende secretie van sommige afgescheiden mature domeinen in vitro en in vivo, onder physiologische condities. Blijkbaar leveren de inherente eigenschappen van de mature domeinen een belangrijke bijdrage. De identificatie van deze eigenschappen wordt bemoeilijkt door technische uitdagingen in de biofysische analyse van niet-natieve eiwit toestanden die essentieel zijn voor secretie. Het doel van deze studie is om de conformationele eigenschappen van deze kortstondige structuren te karakteriseren, dit om inzicht te verkrijgen in de opvouwing van deze unieke eiwit klasse, en in de moleculaire basis van hun interactie met de receptoren tijdens de “targeting”.

Tijdens mijn doctoraatsonderzoek ontwikkelde ik met dit doel voor ogen de methode “Hydrogen/Deuterium eXchange-Mass Spectrometry (HDX-MS)” in het LMB (Rega Instituut), voor de karakterisatie van de targeting-competente, niet-opgevouwen, secretie competente eiwitten, een unicum in België. Deze techniek is zeer geschikt voor het volgen van eiwit vouwing, het vastleggen van intermediaire toestanden en het quantificeren van conformationele verschillen tussen verschillende toestanden (bijv. een preproteïne dat een signaal peptide draagt versus het volwassen proteïne). Onder de juiste condities laat dit de conformationele analyse toe van “disordered” proteïne structuren en zelfs de localisatie van residuele structuren. Bijgevolg is deze techniek een hoeksteen in het begrijpen van dynamische processen binnen de niet-natieve afscheidbare structuren, dewelke zeer moeilijk te volgen zijn met de meeste andere methodes.

Voor een grondige karakterisatie van de eigenschappen die relevant zijn voor ribosoom-membraan transport werden conformationele eigenschappen afgeleid via HDX-MS, en complementaire biofysische technieken, gerelateerd aan “targeting” en secretie, in het bijzonder door gebruik te maken van biochemische assays en mutagenese. Ons proces werd toegepast op meer dan 20 E. coli afgescheiden proteïnes, wat deze studie de eerste analyse van translocatie-competentie maakt die representatief is voor het gehele secretoom.

Het geheel van onze resultaten demonstreert dat afgescheiden eiwitten een unieke structurele klasse vormen, waarvan de primaire sequenties door evolutie op verschillende niveaus geoptimaliseerd werden voor secretie. Ten eerste zijn er naast de signaal peptiden ook secretoire volwassen domeinen die, lineair of drie-dimensionaal, onafhankelijke signalen bevatten die essentieel zijn voor secretie (MTS, mature domain targeting signal). Deze passen in de receptor SecA op een aparte bindingssite, vlak naast deze voor de signaal peptiden. Secretoire proteïnes zijn bijgevolg bivalente, dynamische liganden.

Ten tweede zijn de meeste volwassen domeinen geëvolueerd voor uitgestelde opvouwing, onafhankelijk van het signaal peptide. Zij komen voor in flexibele/ wanordelijke toestanden die de autonome MTS blootstelt. Deze evolutionaire selectie kan bereikt worden door subtiele afwijkingen van de cytoplasmatische homologen.

Ten derde speelt het vroege mature domein van secretoire proteïnes een nieuwe dubbele rol: het is een conformationele weerstand van wanorde en een fysieke linker voor signaal peptiden. Via deze keten kunnen signaal peptiden het wanordelijke ensemble van het daarop volgende volwassen domein fijn afstellen en elk signaal peptide en volwassen eiwit koppel selectief afstellen op basis van deze dynamiek. Extreme manipulatie van volwassen domeinen door signaal peptiden is vastgesteld in enkele eiwitten die opvouwen in zeer stugge structuren in afwezigheid van hun signaal peptide.

Deze nieuwe mechanismes zijn essentieel voor efficiënte proteïne secretie en hebben vertakkingen in eiwitvouwing en proteostase.